Biotecnología – Transformación bacteriana: Laboratorio de biología

Publicado el 17 septiembre, 2020 por Rodrigo Ricardo

Genes y tecnología

Se les llama ‘Frankenfoods’. Los genetistas han tomado fragmentos de ADN de organismos como bacterias y los han introducido en la composición genética del maíz, la soja y otros alimentos. Algunos consumidores desconfían de los efectos que la ingestión de OMG (organismos modificados genéticamente) podría tener en nuestro organismo. Pero los productos fabricados por ingeniería genética , que es cualquier cambio creado por humanos en el ADN de un organismo, no solo se encuentran en nuestros alimentos, están en casi todas partes.

Una de las técnicas de ingeniería genética más comunes se llama transformación bacteriana , el proceso en el que se induce una pieza circular de ADN en un huésped bacteriano. Estos trozos de ADN circular se denominan plásmidos . Puede pensar en los plásmidos como piezas “extra” de ADN; no son parte del genoma principal de la bacteria. Sin embargo, a veces tienen genes que son útiles para ayudar a las bacterias a sobrevivir.

Por ejemplo, algunos plásmidos tienen genes que confieren resistencia a los antibióticos o la capacidad de sobrevivir en presencia de un antibiótico que normalmente los destruiría. Esto es muy útil para las bacterias, ¡pero no tan bueno para nosotros cuando luchamos contra una infección con antibióticos!

Las bacterias pasan estos plásmidos entre ellas de forma natural. Esto puede suceder a través de una infección por un virus o, a veces, a través de dos bacterias que se tocan físicamente para intercambiar información genética, lo que se denomina conjugación. (Por cierto, este intercambio de genes es una de las razones por las que tenemos dificultades con las bacterias que son resistentes a muchos antibióticos comunes).

En este laboratorio, veremos cómo los científicos transfieren un plásmido que confiere resistencia a los antibióticos a las bacterias a través de la transformación, y cómo podemos saber si hemos tenido éxito o no.

Transformación y recubrimiento de E. coli

Comencemos por conocer a nuestro organismo anfitrión. Escherichia coli , comúnmente abreviada como E. coli , es una bacteria común en forma de varilla presente, entre otros lugares, en el sistema digestivo humano. Normalmente, estas bacterias son sensibles al antibiótico ampicilina, es decir, cuando se exponen a este medicamento, no se multiplican de manera muy eficaz o se destruyen por completo.

Tomaremos dos tubos de microcentrífuga, uno con el plásmido (etiquetado +) y otro sin (etiquetado -), y los llenaremos con 250 microlitros de cloruro de calcio. El cloruro de calcio se unirá tanto al ADN plasmídico (que tiene una carga negativa debido a su cadena principal de fosfato) como a la parte cargada positivamente de la membrana celular bacteriana.

A continuación, utilizando una técnica estéril, agregaremos algunas células bacterianas a cada tubo y mezclaremos bien. Luego, agregaremos una solución que contiene plásmidos suspendidos en el tubo (+) y dejaremos que se “enfríen” en hielo durante al menos diez minutos. Esto es importante porque establece el siguiente paso: la descarga térmica.

Durante la descarga de calor , las células a una temperatura muy fría (en hielo) se sumergen repentinamente en un baño de agua caliente que eleva su temperatura a unos 42 grados C, y luego se vuelven a colocar rápidamente en hielo. Este método fomenta que las membranas celulares se vuelvan permeables al ADN plasmídico para que ingrese a la célula. En este punto, con suerte, el plásmido ha sido absorbido por las bacterias en el tubo etiquetado (+).

En ciencia, sin embargo, la esperanza no es suficiente. Necesitamos evidencia, pero ¿cómo deberíamos obtenerla?

Podríamos exponer las bacterias en cada tubo a antibióticos para ver si son resistentes y pueden sobrevivir, o no lo son y morirán. Pero las bacterias están notoriamente malhumoradas por tomar su medicamento. Entonces, crearemos cuatro placas de agar. Dos contendrán solo un medio de crecimiento (agar) y una sustancia llamada caldo de luria (nutrientes), y dos tendrán caldo de luria y ampicilina. Etiquetaremos las placas, inocularemos cuidadosamente cada placa con bacterias del tubo adecuado y luego las incubaremos a 37 grados Celsius durante 24 a 48 horas.

Analizar datos

Antes de examinar las planchas, piense en las siguientes preguntas. ¿Qué esperas ver en cada plato? ¿Cuál fue el propósito de cada plato?

Recuerde, comenzamos con un solo cultivo de E. coli . Lo primero que debemos determinar es si las bacterias de ese cultivo original pudieron resistir nuestras manipulaciones, es decir, ¿sobrevivieron al protocolo de choque térmico? Las bacterias de todo tipo crecen fácilmente en las placas LB. ¿Importa si esas bacterias tienen resistencia a la ampicilina? No Si hemos hecho todo correctamente, deberíamos esperar ver crecimiento en ambas placas LB (solo). Estos aparecen como colonias o áreas circulares de crecimiento en la placa de agar. O, a veces, si hay muchas bacterias, es probable que ocurra lo que se llama césped; aquí es donde se cubre todo el plato.

¿Qué hay de las placas LB / AMP? Normalmente, la ampicilina interfiere con la capacidad de una bacteria para formar una pared celular estructuralmente sólida, evitando el crecimiento de colonias. En resumen, sin plásmido, sin crecimiento. Si realizamos la transformación correctamente, deberíamos ver un crecimiento en la placa LB / AMP (+), pero no en la placa LB / AMP (-).

También podemos completar un cálculo simple para estimar la eficiencia de transformación, el porcentaje aproximado de células transformadas en el tubo LB / AMP (+). Esto se puede hacer usando la fórmula:

Eficiencia de transformación = número total de colonias en una placa / cantidad de ADN transferido en microgramos

Para usar esta fórmula, todo lo que tenemos que hacer es contar las colonias en un plato y dividir ese número por la cantidad de ADN que colocamos en cada plato.

Resumen de la lección

Recapitulemos brevemente esta lección. La transformación bacteriana , el proceso en el que se induce un plásmido en un huésped bacteriano, es un ejemplo de ingeniería genética , que es cualquier cambio creado por humanos en el ADN de un organismo. En este laboratorio, completamos un protocolo que nos permitió colocar un plásmido que confería resistencia al antibiótico ampicilina en la célula huésped bacteriana E. coli .

Después de completar este protocolo, pudimos determinar si la transformación fue exitosa al cultivar bacterias en placas que contenían solo nutrientes o tenían tanto nutrientes como ampicilina. Las bacterias pudieron crecer en ambas placas que contenían solo los nutrientes, pero solo las bacterias que se habían transformado con el plásmido pudieron crecer en colonias en la placa que tenía ampicilina. Esto se debe a que el plásmido contenía un gen de resistencia a los antibióticos.

Los resultados del aprendizaje

Una vez que haya terminado con esta lección, debería poder:

  • Recordemos el papel de los plásmidos en la ingeniería genética.
  • Discutir el proceso de probar y demostrar la transformación bacteriana.
  • Estime la eficiencia de una transformación realizando un cálculo sencillo

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