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Electroforesis: Definición, tipos y usos

Publicado el 10 enero, 2024

¿Qué es la electroforesis?

La electroforesis es el proceso de utilizar un campo eléctrico para separar moléculas según su tamaño y carga. Utiliza una solución tampón electrolítica para ayudar a conducir la electricidad a través de un medio de soporte neutro, como gel de agarosa o papel de filtro. El tipo de moléculas que se analizan determina el tampón, el medio y la cantidad de voltaje eléctrico adecuados necesarios para facilitar el proceso. En la electroforesis, los electrodos se separan en extremos opuestos del sistema para facilitar el movimiento de las moléculas.

Al realizar la anaforesis, las muestras tienen carga negativa y se colocan cerca del cátodo (o polo cargado negativamente) antes de que se active la corriente eléctrica; esto facilita su movimiento a través del medio hacia el ánodo en el polo opuesto. La cataforesis se utiliza para separar partículas cargadas positivamente y utiliza el mismo principio que la anaforesis pero con polos opuestos. Las muestras se colocan cerca del ánodo antes de que se active la corriente, lo que facilita su movimiento a través del medio hacia el extremo del cátodo del sistema. Moléculas con diferentes tamaños y cargas migran a través del medio a diferentes velocidades, creando bandas de regiones con diferentes tipos o tamaños de moléculas separadas entre sí en el medio de soporte. Luego se tiñen para hacerlos visibles y más fáciles de analizar.

La electroforesis juega un papel importante en el estudio de muchos tipos de moléculas y las sutiles diferencias en su tamaño y composición. En particular, se utiliza en el análisis de ADN, incluidas las pruebas de paternidad y la investigación de la escena del crimen, así como en la investigación médica y el estudio de proteínas.

Principio de electroforesis

Ejemplo de medio de gel visible final para analizar después de la electroforesis con 4 muestras

Al realizar la electroforesis, el principio básico es que las moléculas cargadas se separan mediante un campo eléctrico para estudiar su tamaño y composición (en función de la carga), a menudo con el objetivo de comparar diferentes tipos o fuentes de muestras. Debe realizarse en un recipiente que contendrá la solución tampón electrolítica y garantizará que un campo eléctrico uniforme se mueva a través del sistema. Los electrodos se separan en los extremos opuestos del recipiente con el medio de soporte neutro rodeado por una solución tampón entre ellos.

Los tipos de moléculas que se analizan determinan dónde se colocan las muestras en el medio. Si se analizan partículas cargadas positivamente (cataforesis), las muestras se colocan en el polo del ánodo para que migren hacia el cátodo. Si se analizan partículas cargadas negativamente (anaforesis), las muestras se colocan en el polo del cátodo para que migren hacia el ánodo. Si se desconoce la carga o las muestras contienen una mezcla de cargas diferentes, las muestras se colocan en el centro exacto del medio para que las partículas puedan migrar en cualquier dirección según su carga.

Es importante que la electricidad permanezca apagada mientras se preparan las muestras para controlar la cantidad de tiempo que migran a través del sistema y permitir comparaciones válidas. Una vez colocadas las muestras en la zona adecuada del medio, se activa la corriente eléctrica, permitiendo que el campo eléctrico separe las moléculas debido a la separación de los electrodos. Después de un período de tiempo fijo (que depende de la intensidad del voltaje y del tipo de moléculas que se analizan), se corta la corriente. Luego, el medio de soporte se retira de la solución tampón y se analiza, a menudo con tinciones para hacer que las moléculas separadas sean claramente visibles en bandas distintivas.

Historia de la electroforesis

El movimiento de partículas coloidales (pequeñas partículas sólidas suspendidas en un fluido) debido a un campo eléctrico se observó por primera vez en 1807. Sin embargo, no se convertiría en una técnica bien desarrollada para el análisis molecular hasta pasados ​​casi 150 años. A finales de los años 40 y principios de los 50, los investigadores descubrieron que se podía utilizar papel de filtro para crear fricción y suspender las partículas separadas en una posición fija cuando se cortaba la corriente eléctrica, lo que permitía una mayor facilidad para visualizar y estudiar las diferencias en su movimiento. En la década de 1960, los científicos desarrollaron la técnica utilizando geles para estabilizar y fijar aún más la muestra en su lugar, aprendiendo cómo separar eficazmente las partículas de ADN y ARN de formas que antes no habían sido posibles. A finales de la década de 1960, los científicos descubrieron que aislar la agarosa para crear el gel en lugar de utilizar agar natural creaba un medio neutro más estable para la separación y el estudio de muchos tipos de moléculas, incluidas proteínas, ácidos nucleicos y contaminantes ambientales.

Hasta 1972, los isótopos radiactivos se utilizaban para detectar la posición de diferentes moléculas dentro de muestras que habían pasado por electroforesis. Luego, se descubrieron y desarrollaron técnicas de tinción efectivas que permitieron un análisis visual de las muestras más seguro y sencillo. En 1984, se desarrolló la técnica de electroforesis capilar, que permitió un análisis más rápido y preciso debido al pequeño diámetro de los tubos capilares utilizados en el proceso. Esta innovación también allanó el camino para la automatización del proceso, aumentando la eficiencia general del uso de la electroforesis para el análisis molecular. A finales de la década de 1980, los sistemas de electroforesis capilar estuvieron disponibles comercialmente y el uso aplicado de esta tecnología se disparó a partir de ahí. La electroforesis desempeña un papel clave en descubrimientos importantes como el mapeo de genomas (incluido el Proyecto Genoma Humano), el estudio de cánceres y el análisis de contaminantes ambientales, por nombrar algunos. Hoy en día, la electroforesis es una de las técnicas más utilizadas para estudiar moléculas y se ve en todas partes, desde laboratorios de investigación hasta laboratorios criminalísticos y hospitales.

Tipos de electroforesis

Existen varios tipos diferentes de electroforesis que utilizan diferentes tampones electrolíticos y medios de soporte para facilitar la distribución zonal o lineal de las moléculas. Las dos técnicas más comunes son la electroforesis capilar y la electroforesis en placa. Esto se debe a la eficiencia y facilidad de análisis que proporcionan estos dos métodos.

Electroforesis capilar

La electroforesis capilar utiliza tubos capilares o la acción capilar del papel para facilitar el proceso electroforético. Los tubos capilares utilizados en electroforesis suelen estar hechos de sílice, lo que los hace transparentes, y tienen un diámetro de 50 micrómetros. El pequeño diámetro de los tubos capilares aumenta la relación entre el área de superficie y el volumen para la disipación de calor en las muestras, lo que permite utilizar un voltaje más alto en el campo eléctrico y acelerar el proceso. Los siguientes son los pasos de la electroforesis capilar con tubos:

  • Un investigador llena los tubos capilares con un medio en gel, generalmente agarosa, para crear el medio de soporte para el proceso.
  • Luego se agrega un tampón electrolítico para facilitar el flujo de electricidad y se coloca una sola muestra en el extremo apropiado del tubo para permitir que migre hacia el electrodo con carga opuesta.
    • El pequeño volumen dentro de los tubos permite una menor generación de desechos porque no se utiliza mucho gel o tampón para llenar completamente el interior del tubo.
  • Los dos extremos del tubo se sumergen en tanques separados de solución tampón con electrodos opuestos conectados (ánodo en uno, cátodo en el otro) y la electricidad fluye a través del sistema, lo que hace que las partículas migren hacia el electrodo apropiado.
    • El pequeño diámetro y la naturaleza transparente del tubo capilar permiten un análisis UV eficiente para detectar la posición de las partículas dentro del tubo. Esto significa que no existe la misma necesidad de tinción que para la electroforesis en placa y permite una automatización más sencilla del proceso. A veces, sin embargo, todavía se agregan tintes a la muestra antes de la electroforesis para brindar a los investigadores una confirmación visual del movimiento exitoso de las partículas a través del sistema.
  • Luego, los investigadores colocan los tubos capilares en escáneres de computadora UV que crean rápida y fácilmente gráficos que muestran la distribución de las moléculas después de la electroforesis.
La imagen es un dibujo simple de cómo se puede usar un detector en un aparato de electroforesis capilar.

Alternativamente, en la electroforesis capilar se pueden utilizar tiras finas, filtros o papel de cromatografía. La muestra se aplica a un extremo del papel y luego la solución tampón humedece completamente el papel. Cada extremo del papel se sumerge en un tanque de solución tampón y se aplican polaridades opuestas de electrodos a los tanques (ánodo en un lado, cátodo en el otro). Cuando se enciende la electricidad, la muestra se moverá a través del papel hacia el electrodo con carga opuesta. Luego, el papel se seca y se observa mediante un sistema de detección de calidad del sonido. Las áreas del papel donde se han depositado las moléculas serán más densas, afectando así a la transmisión de ondas sonoras a través de esas regiones específicas.

La electroforesis capilar se utiliza para la secuenciación de genomas y el mapeo rápido de ADN o ARN. Las enzimas de restricción pueden cortar muestras en áreas específicas del genoma. Luego se coloca un detector sobre el tubo capilar o papel que es capaz de determinar qué nucleótido específico pasa a través de él en un punto determinado. Las hebras más largas migran más lentamente a través del sistema que las más cortas, lo que permite a los investigadores determinar el orden exacto de los nucleótidos a medida que pasan.

Electroforesis en losa

La electroforesis en placa se usa más comúnmente para analizar moléculas más grandes, como proteínas complejas, y comparar diferentes muestras entre sí.

foto de una losa de gel etiquetada que muestra los pocillos y las muestras separadas

Pasos en la electroforesis en losa:

  • Un investigador prepara una placa de gel, como agarosa, con pocillos en un extremo en una bandeja o plato.
  • Luego sumergen la losa en una única cámara de solución tampón con electrodos en extremos opuestos (cátodo en un extremo, ánodo en el otro).
  • Una micropipeta carga muestras preparadas y teñidas en los pocillos antes de encender la fuente de alimentación.
    • Se utiliza una tinción inicial en las muestras para permitir la confirmación visual de que las moléculas se están moviendo y para determinar cuándo apagar el suministro de energía (antes de que las moléculas migren completamente al extremo opuesto de la losa). Permanecerá al frente de la migración de la molécula pero no manchará las moléculas que están siendo separadas por el gel (como se ve en la imagen).
    • A menudo se utilizan muestras estándar o conocidas en el borde de la losa, ya sea en el pozo más a la derecha o más a la izquierda, para crear una escala dentro de la propia losa para una comparación visual rápida y sencilla.
  • Una vez cargadas las muestras, se enciende la fuente de energía y las moléculas migran a través del gel hacia el electrodo con carga opuesta.
  • Una vez que las moléculas han migrado, se corta la corriente y se retira el gel.
  • Luego se tiñe toda la placa para ver la posición exacta de las moléculas dentro de la placa de gel y se pueden comparar varias muestras no solo entre sí sino también con la escala conocida creada por el estándar que se agregó en el margen.
    • Esto produce la imagen con la que la mayoría de las personas probablemente estén familiarizadas cuando imaginan la electroforesis.

Los investigadores combinan la electroforesis en placa con otras técnicas para investigaciones e investigaciones más complejas. Por ejemplo, en la inmunoelectroforesis, las proteínas primero se separan mediante el proceso estándar y luego se incuban con un antisuero durante un período de 8 a 20 horas. A continuación se puede detectar la unión del antisuero y determinar las proteínas específicas que desencadenan una respuesta inmunitaria. El isoelectroenfoque utiliza un gradiente de pH creado dentro de la losa para facilitar la separación de moléculas con diferente pH en lugar de tamaño. Esto es útil para separar moléculas de tamaño similar, como cadenas peptídicas y proteínas complejas. Cuando se aplica el campo eléctrico al sistema, las moléculas migran según el gradiente de pH. La electroforesis en placa también se puede utilizar para separar moléculas grandes y complejas, como proteínas, de ácidos nucleicos mediante electroforesis de zona. En la electroforesis de zona, hay diferentes amortiguadores presentes en diferentes áreas del sistema que afectarán la velocidad de las partículas que se separan de diversas maneras. Esto permite que diferentes moléculas se asienten en áreas o zonas claramente diferentes de la losa.

¿Para qué se utiliza la electroforesis?

La electroforesis es una de las técnicas más comunes utilizadas hoy en día para analizar moléculas en los laboratorios. Tiene muchas aplicaciones, no sólo en el campo de la investigación, sino también en la medicina, la ciencia forense y la investigación medioambiental. Algunos usos comunes incluyen:

  • Prueba de paternidad
  • ADN/secuenciación genómica
  • Investigación sobre el cáncer
  • Terapias basadas en el sistema inmunológico
  • Análisis de proteínas
  • Análisis de contaminantes
  • Análisis de pureza de procesos industriales o químicos.
  • Investigación forense (basada en el medio ambiente y en la escena del crimen)
  • Aseguramiento del control de calidad en procesos industriales o químicos.

Resumen de la lección

La electroforesis es una técnica moderna comúnmente utilizada para aplicar un campo eléctrico para separar diferentes moléculas cargadas en una solución según su tamaño y carga. La anaforesis hace que las partículas cargadas negativamente sean atraídas hacia el electrodo cargado positivamente del sistema (ánodo), mientras que la cataforesis hace que las moléculas cargadas positivamente sean atraídas hacia el electrodo cargado negativamente (cátodo). Este fenómeno se observó por primera vez a principios del siglo XIX; sin embargo, no se desarrolló bien hasta la segunda mitad del siglo XX debido a los avances tecnológicos. Los dos modos principales de electroforesis en la actualidad son la electroforesis capilar y la electroforesis en gel en placa. Se utilizan para una amplia gama de importantes aplicaciones de investigación, médicas y de campo, incluida la secuenciación de ADN, el análisis de proteínas y la regulación industrial mediante análisis de pureza y contaminantes.

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