Bromuro de etidio, tampón de carga y escala de ADN: visualización del ADN y determinación de su tamaño

Revisión de electroforesis en gel

La electroforesis en gel de agarosa juega un papel fundamental en el análisis de ADN en experimentos de laboratorio. Es un método para separar moléculas biológicas mediante una corriente eléctrica. Anteriormente aprendimos que las moléculas de ADN pueden abrirse camino a través de los poros en un gel de agarosa. La carga negativa de las moléculas de ADN las impulsa a través del campo eléctrico hacia el electrodo positivo. Las moléculas de ADN más cortas pueden viajar más lejos en un gel de agarosa en un período de tiempo determinado que sus contrapartes más largas. La electroforesis en gel de agarosa proporciona un medio para analizar el ADN mediante la separación de moléculas según el tamaño. Sin embargo, en sí misma, la electroforesis en gel de agarosa no proporciona un medio para visualizar el ADN. Ese papel lo desempeñan dos tintes: bromuro de etidio y tampón de carga.

Bromuro de etidio

El bromuro de etidio se une al ADN y emite fluorescencia bajo luz ultravioleta

El bromuro de etidio es una molécula comúnmente utilizada para visualizar ADN en experimentos de electroforesis en gel de agarosa. Se une al ADN y emite fluorescencia en las condiciones adecuadas. El bromuro de etidio se conoce como agente intercalante. La estructura plana del bromuro de etidio le permite intercalarse o insertarse entre bases nitrogenadas de una molécula de ADN. Esta interacción es especialmente útil debido a la segunda característica del bromuro de etidio. Cuando se expone a la luz ultravioleta, el bromuro de etidio emite fluorescencia. Por tanto, esta sustancia química proporciona tanto un medio para marcar moléculas de ADN como un medio para visualizarlas.

Sin embargo, tenga en cuenta que cualquier molécula que se una o altere de alguna manera la estructura molecular del ADN puede ser peligrosa para un organismo vivo. Aunque existe cierto debate sobre la naturaleza exacta del riesgo para la salud que representa la exposición al bromuro de etidio, la mayoría de las organizaciones y agencias lo consideran un riesgo. Debido a la característica de intercalación del bromuro de etidio, muchos creen que presenta un riesgo mutagénico. Sin embargo, con fuertes protocolos de seguridad, el bromuro de etidio sigue siendo uno de los métodos más comunes para visualizar ácidos nucleicos en experimentos de electroforesis en gel de agarosa.

Buffer de carga

Bueno, ese es el final de la historia, ¿verdad? La agarosa separará las moléculas de ADN según el tamaño, y el bromuro de etidio marcará las moléculas para que podamos visualizarlas bajo luz ultravioleta. Bueno no exactamente. El ADN, como muchas moléculas biológicas, es incoloro. Para completar el circuito eléctrico, el gel debe bañarse en una solución salina llamada tampón de electroforesis. El agua también es incolora. ¿Ves el problema?

El tampón de carga es una solución que se agrega a una muestra de ADN para que sea visible a simple vista.

Si el ADN es incoloro y el tampón de electroforesis que baña el gel de agarosa también es incoloro, ¿cómo vamos a saber si hemos insertado la muestra de ADN en el pocillo del gel o no? Podríamos agregar bromuro de etidio y realizar todo el protocolo bajo luz ultravioleta, pero eso parece innecesariamente peligroso para nuestra salud. La respuesta es que necesitamos usar una solución diferente, llamada buffer de carga . El tampón de carga se agrega a una muestra de ADN para darle color a simple vista.

Tenga en cuenta que monitorear la progresión de las moléculas de tinte en el gel también nos permitirá determinar cuándo se completa el protocolo. Fantástico. Ahora puedo decir si inserté con precisión nuestra muestra de ADN en el pozo. Pero todavía hay un problema más. El ADN es una molécula acuosa.

Eso significa que es hidrofílico y se disolverá en agua. Si nuestras muestras de ADN se disuelven en el agua del tampón de electroforesis, las moléculas de ADN se esparcirán uniformemente por toda la solución y no permanecerán localizadas en el pozo dado.

Por lo tanto, el tampón de carga proporciona una función más en la electroforesis en gel. La carga de tampón también aumenta la densidad de la muestra. Recuerde que los objetos más densos se hunden, por lo que agregar tampón de carga a las muestras de ADN permitirá que las moléculas de ADN se hundan en los pocillos del gel en preparación para la electroforesis en gel.

Escalera de ADN

Si bien la visualización cualitativa de moléculas de ADN es ciertamente útil, los experimentos a menudo requieren un análisis mucho más preciso del tamaño de los fragmentos de ADN. En lugar de solo poder concluir que el fragmento uno es más grande que el fragmento dos, los científicos a menudo necesitan poder concluir que el fragmento uno tiene tres kilobases y el fragmento dos es una kilobase. Para poder determinar el tamaño de un fragmento de ADN, los científicos usan algo llamado escalera de ADN. Una escalera de ADN es una solución compuesta por fragmentos de ADN de longitud conocida.

Una escalera de ADN ayuda a los científicos a determinar el tamaño de un fragmento de ADN

Dado que se conoce el tamaño de cada banda en una solución de escalera de ADN, se pueden usar para determinar el tamaño de los fragmentos de ADN en muestras experimentales. Considere el siguiente experimento. Se ha digerido una pieza de cuatro kilobase de ADN lineal con una enzima de restricción. Una escalera de ADN, ADN sin cortar y muestras de ADN digerido se han procesado en un gel de agarosa. ¿Ves cómo las bandas de la escalera de ADN proporcionan un punto de comparación para las muestras experimentales? Dado que conocemos los tamaños de los fragmentos de ADN en cada banda, podemos confirmar que el fragmento sin cortar tiene cuatro kilobases porque se alinea con el fragmento de cuatro kilobases en la muestra de la escalera de ADN.

También podemos determinar que la enzima de restricción ha cortado este fragmento en fragmentos de tres y una kilobase comparando las bandas en el carril de la muestra digerida con las del carril de la escalera de ADN. Para las bandas que no se alinean perfectamente con una de las bandas en la escalera de ADN, el tamaño puede estimarse a simple vista o determinarse mediante un cálculo matemático. De esta forma, los científicos pueden utilizar la electroforesis en gel para verificar o descubrir el tamaño de los fragmentos de ADN.

Resumen de la lección

En resumen, la electroforesis en gel de agarosa es un método para separar moléculas biológicas utilizando una corriente eléctrica. El bromuro de etidio es una molécula comúnmente utilizada para visualizar ADN en experimentos de electroforesis en gel de agarosa. Se intercala entre las bases nitrogenadas del ADN y emite fluorescencia bajo luz ultravioleta.

El tampón de carga es una solución que se agrega a una muestra de electroforesis para darle color y densidad. Una escalera de ADN es una solución compuesta por moléculas de ADN de longitud conocida que se utiliza para determinar el tamaño de los fragmentos de ADN en muestras experimentales.

Los resultados del aprendizaje

Después de ver esta lección, debería poder:

• Definir electroforesis en gel de agarosa, escalera de ADN y tampón de carga
• Recuerde los atributos del bromuro de etidio
• Analizar tamaños de muestras de ADN en experimentos de electroforesis