Electroforesis en gel de agarosa: procedimiento y análisis

Una carrera de obstáculos de ADN

Imagínese una carrera de obstáculos de cuerdas que consiste en una enorme caja rectangular con cuerdas tendidas entre las paredes, que se cruzan en todas direcciones. Los competidores de la carrera de obstáculos comienzan en un extremo y la primera persona en llegar al otro lado gana. Ahora, debes apostar quién ganará la carrera. Hay dos competidores: un tipo bajo y delgado y un tipo alto y musculoso. ¿En cuál apostaste? Creo que la mayoría de la gente apostaría por el pequeño. Se deslizaba por los agujeros de las cuerdas y rápidamente se dirigía al otro lado, mientras que el tipo grande se enredaba y tal vez no entraba en los espacios pequeños. Tenga en cuenta esta competencia, porque ese tipo de carrera de obstáculos y nuestros competidores es en realidad una analogía bastante buena de cómo las moléculas de ADN se mueven a través de una sustancia llamada agarosa.

Electroforesis en teoría

Electroforesis es el término técnico para el movimiento de moléculas cargadas por una corriente eléctrica. El ADN resulta ser una molécula cargada, y la electroforesis se usa con frecuencia para analizar el ADN. El ADN es una molécula compleja que consta de cadenas de moléculas de azúcar con las conocidas piezas A, G, C y T unidas a un lado y moléculas de fosfato que sobresalen del otro lado. Cuando el ADN forma la clásica doble hélice, las partes A, G, C y T se adhieren a la hélice, formando los «peldaños» de la escalera, mientras que los grupos fosfato cargados negativamente sobresalen. Si coloca el ADN en un campo eléctrico, el ADN cargado negativamente será repelido por el electrodo negativo y atraído por el electrodo positivo. Esto puede hacer que el ADN se mueva en respuesta a la corriente que fluye entre los dos electrodos. Entonces eso explica cómo podemos hacer que el ADN se mueva, pero eso realmente no nos ayuda mucho si queremos analizar una muestra de ADN para ver cuántas piezas o de qué tamaño hay en nuestra muestra. Necesitamos una forma de separar nuestro ADN según el tamaño. Aquí es donde entra la analogía de la carrera de obstáculos con cuerdas. Necesitamos una carrera de obstáculos para nuestro ADN que permita que las moléculas pequeñas se muevan más rápido y se adelanten a las más grandes. Esta carrera de obstáculos se presenta en forma de agarosa , una gran molécula compleja hecha de algas. Cuando la agarosa se disuelve en una solución de agua, se endurece en una sustancia similar a la gelatina con las grandes moléculas de agarosa formando una estructura similar a una red en su interior; esto es similar a las cuerdas en nuestra carrera de obstáculos con cuerdas. Ahora, si colocamos esa placa de agarosa en nuestro campo eléctrico, podemos atraer las moléculas de ADN al electrodo positivo mientras las hacemos viajar a través de la agarosa. Las piezas más pequeñas navegarán por el laberinto de agarosa más rápido que las piezas más grandes, que se quedarán atrás. La combinación de estos dos principios se denomina electroforesis en gel .

La electroforesis en gel en la práctica

Ahora que entendemos la teoría de la electroforesis en gel, veamos cómo funciona en la práctica. El primer paso es hacer el gel de agarosa. Estos geles se colocan en pequeñas bandejas rectangulares y se coloca un peine en un extremo para hacer pequeños agujeros, o pozos, para colocar el ADN más tarde. Una vez que el gel está listo, se coloca en una caja rectangular que contiene electrodos en cada extremo de la caja. Los pocillos para el ADN se colocan cerca del electrodo negativo. Para permitir que la corriente eléctrica viaje entre los electrodos, la caja se llena con una solución de agua y sal. ¡Ahora estamos listos para nuestras muestras!

Un laboratorio preparado para electroforesis en gel de agarosa.

Las muestras de ADN se mezclan con un tampón de carga que contiene tintes que ayudan a que el ADN se hunda en los pozos y nos ayudan a rastrear el movimiento del ADN. Luego, las muestras se insertan cuidadosamente en los pocillos del gel con una micropipeta. Además de nuestras muestras de ADN, se coloca una escalera de ADN en un pozo, y la escalera contiene piezas de ADN conocidas en una variedad de tamaños. Una vez que las muestras se colocan en el gel, se coloca una tapa en la caja y los electrodos se conectan a una fuente de alimentación. A medida que la corriente eléctrica se mueve a través del gel, no solo mueve el ADN sino también las moléculas de tinte, que se mueven un poco más rápido que el ADN. Esto nos ayuda a realizar un seguimiento de dónde está el ADN, por lo que no dejamos que el ADN se salga del final de la carrera de obstáculos de agarosa. Cuando el ADN ha tenido tiempo de moverse a través del gel, se apaga la fuente de alimentación y se saca el gel de la caja. Luego se agrega al gel un tinte de unión al ADN, típicamente bromuro de etidio. El tinte se pega entre los peldaños A, G, C y T del ADN y, bajo una luz ultravioleta, emite fluorescencia y nos muestra dónde está el ADN en nuestro gel.

Bandas de ADN de diferentes tamaños en un gel. La flecha verde indica la dirección del movimiento del ADN a través del gel.

Aplicaciones de electroforesis en gel

¿Por qué es útil separar nuestro ADN por tamaño? Bueno, en realidad hay muchas aplicaciones para esta tecnología en el mundo de la biología molecular. Pero echemos un vistazo rápido a dos ejemplos. Durante el proceso de clonación molecular, los científicos cortan genes de fragmentos más grandes de ADN, lo que se denomina digestión de restricción . Si tiene un fragmento largo de ADN y agrega una enzima para eliminar el gen de interés, entonces el fragmento largo debería acortarse. Puede verificar este procedimiento de corte mirando su largo trozo de ADN en el gel y comparándolo con las muestras de ADN que han sido tratadas con la enzima, donde debería ver fragmentos más cortos que representan los trozos cortados. La electroforesis en gel también se utiliza cuando los científicos pegan o ligan piezas de ADN para formar una pieza más grande, lo que se denomina reacción de ligadura . El éxito de la reacción de ligadura se puede verificar comparando el tamaño de las piezas iniciales de ADN con el tamaño del ADN después de la reacción de ligadura. Si las piezas más pequeñas de ADN se pegaron con éxito, verá una pieza más grande de ADN en el gel.

Resumen de la lección

La electroforesis en gel es una técnica de laboratorio que separa moléculas cargadas, como el ADN , según el tamaño. El aspecto del gel se refiere al uso de la molécula compleja agarosa que proporciona un tamiz molecular para separar moléculas por tamaño. El aspecto de la electroforesis se refiere al uso de un campo eléctrico para mover las moléculas cargadas usando simples fuerzas de atracción y repulsión. En el laboratorio, esta técnica consiste en un aparato que contiene un ladrillo de agarosa con orificios para agregar muestras; el ladrillo de agarosa se coloca en una caja llena de agua que contiene sales que conducirán la corriente eléctrica. La electroforesis en gel tiene muchas aplicaciones, incluido el uso para verificar cuándo se han cortado trozos de ADN mediante digestiones de restricción y cuándo se han combinado trozos de ADN en trozos más grandes mediante reacciones de ligación .

Rodrigo Ricardo Editor y fundador