Inmunofluorescencia: definición, procedimiento y aplicaciones

¿Qué es la inmunofluorescencia?

Imagínese subirse a su bicicleta para ir a la casa de un amigo después de la cena. En el invierno, oscurece bastante temprano y usas jeans oscuros y una chaqueta negra. ¿Cómo se asegurará de que los automóviles y otros ciclistas lo vean en la carretera? Muchos ciclistas colocan múltiples luces en sus cuerpos y bicicletas mientras andan en bicicleta por la noche. Una luz delantera y trasera ayuda, y algunos incluso hacen un esfuerzo adicional para agregar luces de colores brillantes en sus rayos, para que sus ruedas se iluminen por la noche.

Resulta que el uso de luces de colores brillantes funciona bien no solo para bicicletas, sino también en laboratorios de biología molecular.

Las proteínas son los componentes de trabajo de las células. Realizan todas las estructuras y funciones celulares. A menudo, durante una enfermedad como el cáncer o la diabetes, no se regula la cantidad de ciertas proteínas que se producen o cómo se comportan las proteínas. Los científicos deben rastrear estos cambios para comprender qué está causando una enfermedad. Pero las proteínas van más allá de lo microscópico, ¿cómo podemos encontrarlas en la célula?

Como nuestro ciclista, una respuesta es la inmunofluorescencia. En este procedimiento, las proteínas se marcan con un anticuerpo fluorescente que brilla cuando se coloca bajo la longitud de onda de luz correcta. Esto permite a los científicos ver proteínas que de otro modo serían invisibles, ¡incluso bajo un microscopio de alta potencia!

Procedimiento

1. Fijadores

En primer lugar, las células que los científicos quieren analizar deben congelarse en el tiempo con un fijador. Las células se pueden fijar en sus placas de crecimiento, pero más a menudo se colocan en placas de microscopio para una fácil visualización. Los fijadores son sustancias químicas que matan las células y las conservan perfectamente. Por lo general, los científicos usan formaldehído al 4% diluido en un tampón llamado PBS para este paso, similar al que usan los funerarios para preservar los cuerpos humanos. Después de que los portaobjetos se hayan fijado durante aproximadamente 5 minutos, los portaobjetos se lavan con PBS, normalmente tres veces.

2. Permeabilización

A menudo, las proteínas que los científicos quieren observar están dentro de las células, pero las células están protegidas por una membrana celular. Para que los anticuerpos inmunofluorescentes accedan a las proteínas, los científicos deben romper la membrana celular en un paso llamado permeabilización. Esto generalmente se hace usando un detergente llamado Triton-X 100 diluido en PBS a aproximadamente 0.1 – 0.25%. Después de la permeabilización, los portaobjetos se lavan de nuevo con PBS.

3. Bloqueo

Los anticuerpos son pegajosos y, a veces, se unen a proteínas con las que no son compatibles durante la tinción. Esto crea ruido de fondo y no ayuda a los científicos a localizar la proteína de interés real. Para detener esta unión no específica, los científicos usan el bloqueo. Durante la etapa de bloqueo, las células se incuban con un tampón de bloqueo que contiene proteína que se unirá a sitios no específicos de las células, impidiendo que entren en contacto con el anticuerpo. Los científicos a menudo usan albúmina de suero bovino (BSA) diluida aproximadamente al 1% en PBS como tampón de bloqueo entre 30 y 60 minutos. Después del bloqueo, los portaobjetos se lavan con PBS.

4. Anticuerpo primario

A continuación, es el momento de aplicar el anticuerpo primario. El anticuerpo primario es una combinación perfecta para las proteínas que buscan los científicos. El anticuerpo primario se diluye en PBS de acuerdo con las instrucciones del fabricante y luego se aplica a las células. Los científicos pueden incubar las células con el anticuerpo primario durante una hora a temperatura ambiente, o pueden dejarlo reposar durante la noche en el frío. Depende del experimento, el anticuerpo primario y la proteína diana. Después de la incubación, los portaobjetos se lavan de nuevo con PBS.

5. Anticuerpo secundario

¡Ahora es el momento de las luces! Aunque a veces en la inmunofluorescencia directa el anticuerpo primario contiene el fluoróforo, la mayoría de las veces se aplica un anticuerpo secundario para amplificar la señal y aumentar la sensibilidad.

El anticuerpo secundario es compatible con el anticuerpo primario y contiene una etiqueta inmunofluorescente. Diferentes anticuerpos secundarios se unen a diferentes anticuerpos primarios y pueden tener fluoróforos de diferentes colores, por lo que una muestra podría teñirse para más de una proteína a la vez. El anticuerpo secundario también se diluye en PBS y se incuba con la muestra, generalmente durante aproximadamente 1 hora en la oscuridad para que el fluoróforo no sea fotoblanqueado por la luz.

6. Observación

Ahora los portaobjetos se pueden ver bajo un microscopio especial que tiene la luz de longitud de onda correcta para excitar los fluoróforos. La proteína brillará según el color del fluoróforo si está presente en la muestra.

Aplicaciones

La principal aplicación de la inmunofluorescencia es detectar proteínas o ADN que están más allá de lo microscópico dentro o alrededor de las células. Dado que las proteínas son las partes funcionales de las células, los cambios en las proteínas cambian la forma en que se comportan las células y pueden provocar estados de enfermedad. Por ejemplo, durante la enfermedad de Alzheimer, la proteína beta amiloide se acumula alrededor de las neuronas, lo que provoca la muerte de las células neuronales. La acumulación se puede observar mediante inmunofluorescencia.

La inmunofluorescencia también se puede utilizar para identificar infecciones virales, como la rabia o el sarampión. Las células que están infectadas con el virus mostrarán proteínas virales, que pueden detectarse por inmunofluorescencia, lo que indica una infección.

También se puede utilizar para identificar patógenos desconocidos en una muestra de paciente. Las células se pueden teñir para una proteína particular exclusiva del patógeno de interés. Si la proteína está presente, el paciente puede estar infectado con ese patógeno.

Resumen de la lección

La inmunofluorescencia es una técnica de biología molecular que se puede utilizar para identificar proteínas o ADN dentro de las células. Las células se incuban primero con un fijador, como formaldehído, y luego se lavan en PBS. Luego, si el objetivo está dentro de la célula, se permeabilizan con un detergente, como Triton-X 100. A continuación, se aplica el anticuerpo primario para que se adhiera a la proteína objetivo y luego se aplica un anticuerpo secundario con el fluoroflore. Después del lavado, las células están listas para su visualización bajo una fuente de luz específica que excitará el fluoróforo. La inmunofluorescencia se puede utilizar para localizar proteínas, observar cambios en la función de las proteínas o identificar patógenos durante una infección.