Ingeniería genética y transformación bacteriana
Hemos estado discutiendo un método para crear insulina humana para pacientes diabéticos. Hasta este punto, nuestros esfuerzos se han centrado en crear un plásmido de ADN recombinante que pueda expresar insulina humana. Pero, si recuerda, nuestro plan final es conseguir que las células bacterianas produzcan insulina. Eso significa que necesitamos introducir nuestro plásmido de insulina humana en una célula bacteriana. ¿Es eso factible?
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Bueno, por suerte para nosotros, hay varias formas de modificar genéticamente las células bacterianas. Uno de los procedimientos más comunes que se utilizan tanto en laboratorios como en aulas se conoce como transformación . La transformación es el proceso en el que la composición genética de una célula cambia mediante la introducción de ADN del entorno circundante.
Los científicos usan comúnmente las bacterias que se encuentran en nuestro intestino en experimentos de transformación bacteriana. Esta bacteria se conoce como Escherichia coli o E. coli para abreviar. E. coli es uno de los organismos más utilizados en experimentos científicos.
Las células bacterianas que están creciendo activamente son las más susceptibles a la transformación bacteriana. Sin embargo, deben someterse a una serie de tratamientos antes de que sean competentes para la transformación. Hay varias formas de hacer que las células sean competentes para la transformación, pero consideraremos la versión más simple, que solo requiere cloruro de calcio, hielo y calor.
Cloruro de calcio
Recuerde que una célula está rodeada por una membrana celular compuesta de moléculas de fosfolípidos. Los fosfolípidos están organizados en una bicapa lipídica en la que las colas hidrófobas apuntan hacia adentro y las cabezas hidrófilas apuntan hacia afuera. Dado que la cabeza hidrófila posee un grupo fosfato electronegativo, el exterior de la membrana bacteriana está cargada negativamente.
Mutaciones y reparación del ADN: mecanismos y consecuencias
También hemos aprendido que el ADN está cargado. El grupo fosfato en las moléculas de ADN también le da al ADN una carga negativa.
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¿Alguien ve algún problema con esto? Queremos introducir el ADN en la célula, ¿verdad? Pero, si el ADN y la membrana celular tienen la misma carga, esto será como intentar juntar el lado negativo de dos imanes. ¡El ADN y la membrana celular se van a repeler!
Bañar las células bacterianas en la solución salina de cloruro de calcio resuelve este problema. Los iones de calcio son atraídos tanto por la membrana celular cargada negativamente como por las moléculas de ADN en la solución.
La estrecha proximidad de los iones cargados positivamente a estas cargas negativas neutraliza efectivamente la carga tanto en la membrana celular como en las moléculas de ADN. Esto permite que el plásmido de ADN se mueva hacia la membrana celular sin ser repelido.
Golpe de calor
Bueno, conseguir que el plásmido de ADN esté cerca de la membrana celular es solo la mitad de la historia. De alguna manera, necesitamos mover el plásmido a la célula. Los científicos determinaron que un aumento repentino de la temperatura podría impulsar un plásmido al interior de una célula bacteriana. Este tratamiento se llama choque térmico .
Replicación del ADN: mecanismos y errores
Mientras que las células y el ADN se incuban con la solución de cloruro de calcio, toda la solución se enfría en hielo. Luego, la solución de células / ADN se retira del baño de hielo y se calienta brevemente a 42 grados Celsius .
Este pulso de calor induce a algunos plásmidos a entrar en las células bacterianas. Es importante tener en cuenta que enfriar la solución de células / ADN es crucial para que ocurra la transformación porque la diferencia entre la temperatura ambiente y 42 grados Celsius es insuficiente.
Los científicos no están exactamente seguros de cómo funciona la transformación. Una teoría es que el tratamiento de choque térmico abre eficazmente los poros de la membrana celular a través de los cuales puede viajar una molécula de plásmido.
También se cree que el diferencial de calor entre el exterior y el interior de la célula puede proporcionar la fuerza que empuja el plásmido hacia el interior de la célula. Se transporta un plásmido a medida que el agua tibia se precipita a través del poro para igualar la temperatura. Puede pensar en ella como la puerta de entrada a su casa con calefacción en un frío día de invierno. Si deja la puerta abierta, la puerta puede cerrarse de golpe cuando el aire caliente dentro de la casa se precipita hacia afuera.
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Pocas células se transforman alguna vez durante este proceso. Ésa es una de las razones por las que el uso de bacterias como huésped es tan útil.
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Crecimiento y recuperación óptimos
Debido a que E. coli se reproduce tan rápidamente, incluso una célula transformada puede convertirse rápidamente en millones de células que portan el plásmido recombinante. Ahora, tal vez se pregunte: «Si 42 grados es bastante ineficiente, ¿por qué no aumentar la temperatura o prolongar el choque térmico?»
Recuerde que estamos tratando con células vivas. Y recuerde que la E. coli se encuentra naturalmente en nuestro intestino. Eso significa que la temperatura de crecimiento óptima para ellos es la temperatura del cuerpo humano, o 37 grados Celsius. Las temperaturas de choque térmico más altas o los choques térmicos más prolongados simplemente matan a la E. coli .
Las células de E. coli suelen tener tiempo para recuperarse en un caldo de nutrientes después del paso de choque térmico. Esto le da a las células tiempo para recuperarse antes del siguiente paso del proceso. Sin embargo, el paso de recuperación de la transformación bacteriana es un poco más complicado que simplemente dar tiempo a las células para que descansen. Revisaremos la verdadera razón del paso de recuperación en un minuto.
Selección de antibióticos
Dado que el proceso de transformación es ineficaz, necesitamos una forma de distinguir las pocas células transformadas de muchas células no transformadas. Afortunadamente, la mayoría de los plásmidos utilizados en experimentos de transformación incluyen un marcador seleccionable.
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Cuando la célula huésped en un experimento de transformación es bacteriana, como E. coli , la selección se logra mediante el uso de un antibiótico, como la kanamicina. Recuerde que nuestro plásmido de insulina humana también contiene un gen de resistencia a los antibióticos. Eso significa que el crecimiento de células bacterianas en presencia de ese antibiótico específico, digamos kanamicina, seleccionará las células transformadas.
La selección de bacterias transformadas se realiza típicamente en un medio sólido llamado agar. El agar es una versión menos refinada de agarosa, el polisacárido aislado de las algas que nos permitió separar el ADN según el tamaño durante la electroforesis en gel. Al igual que la agarosa, también posee propiedades similares a las de la gelatina. Por lo general, se forma en discos en placas de Petri para el crecimiento bacteriano.
Solo las bacterias que se han transformado con el plásmido de insulina humana crecerán en las condiciones de los antibióticos porque expresan una proteína que confiere resistencia a los antibióticos a la kanamicina. Esta proteína de resistencia a los antibióticos es la razón principal del paso de recuperación.
Tenga en cuenta que la mayoría de los antibióticos, como la kanamicina, simplemente matan las bacterias. Para sobrevivir en el entorno antibiótico de este paso de selección, una célula bacteriana ya debe tener a mano la proteína de resistencia a los antibióticos. Sin embargo, dado que esta proteína no es necesaria en condiciones normales de crecimiento, no se produce hasta que se necesita. Por lo tanto, el paso de recuperación da a las células bacterianas modificadas genéticamente el tiempo necesario para producir la proteína de resistencia a los antibióticos que las protegerá de la selección de antibióticos.
Resumen de la lección
En resumen, la transformación es el proceso en el que la composición genética de una célula cambia mediante la introducción de ADN del entorno circundante. Para que las células bacterianas sean competentes para la transformación, las células se incuban en cloruro de calcio enfriado.
El choque térmico es un aumento repentino de la temperatura que se utiliza para impulsar un plásmido al interior de una célula bacteriana.
El paso de recuperación de un experimento de transformación bacteriana da tiempo a las bacterias modificadas genéticamente para producir proteínas de resistencia a los antibióticos.
En un experimento de transformación bacteriana, la selección de antibióticos se usa para aislar las células transformadas eliminando las no transformadas.
Resultado de aprendizaje
Al final de este video, podrá explicar los pasos involucrados en la transformación bacteriana, incluida la importancia del choque térmico y la selección de antibióticos.
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