Electroforesis en gel de acrilamida: propósito y procedimiento

¿Qué es la electroforesis en gel de acrilamida?

Cuando tenemos un gran desorden de información, generalmente el primer paso es examinarlo y organizarlo. Al leer un texto complejo, esto podría significar hacer un bosquejo y resaltar hechos importantes del capítulo. Los científicos tienen una estrategia similar para comprender la complejidad de las células vivas; clasifique la información y cree un orden para comprender lo que está sucediendo. En las células, las proteínas son las unidades funcionales. Dan estructura a las células y les permiten llevar a cabo todas sus funciones. Los cambios en la estructura o función de las proteínas son el comienzo de muchos procesos de enfermedades, como el cáncer y la diabetes. Pero hay millones de proteínas dentro de las células en un momento dado. Los científicos necesitan una forma de clasificar estas proteínas para ver qué cambios están ocurriendo en un estado de enfermedad. Una forma de hacerlo es mediante electroforesis en gel de acrilamida . En este proceso, se pasa una muestra que contiene proteínas a través de un gel y las proteínas se clasifican por tamaño. Las proteínas más grandes tardan más en migrar a través de la matriz de acrilamida y, por lo tanto, aparecen en la parte superior del gel. Las proteínas más pequeñas se mueven más rápido y migran hacia el fondo. Después de clasificar las proteínas por tamaño, los científicos pueden realizar una variedad de otras pruebas utilizando el gel para identificar qué proteínas están presentes o ausentes.

Preparación

El primer paso para realizar la electroforesis en gel de acrilamida es preparar el gel. Aunque hoy en día se pueden comprar fácilmente geles prefabricados en empresas de suministros científicos, también se pueden fabricar geles en el laboratorio desde cero. Para preparar un gel de acrilamida, los primeros investigadores combinan acrilamida con bisacrilamida. El porcentaje de acrilamida varía según los tipos de proteínas que se resuelven con el gel. Estos dos componentes se diluyen con agua y tampón. Justo antes de colar el gel, se añaden los agentes polimerizantes, persulfato de amonio (APS) y TEMED (N, N, N, N’-tetrametilendiamina). Estos catalizan la polimerización y transforman el líquido en un gel. Luego, la solución se vierte entre dos placas de vidrio para que fragüe. Por lo general, se utilizan dos geles juntos para la electroforesis de acrilamida. La parte inferior del gel es el gel de resolución, compuesto por un mayor porcentaje de acrilamida. La parte superior del gel está hecha de un gel apilable, hecho de un porcentaje más bajo de acrilamida. Esto permite que las proteínas se muevan más rápido y se concentren en una banda ordenada antes de separarse en el gel de resolución. El resultado es una mejor resolución de la separación.

Procedimiento

Una vez que los geles están hechos, ¡es hora de comenzar a separar!

Paso 1: configurar el aparato

Primero, el gel debe retirarse de las placas de fundición si es necesario. Luego, se sujeta al aparato de gel con el conjunto de electrodos. Una vez que todo está colocado, el aparato se cierra con pinzas y se puede llenar con tampón de funcionamiento hasta los pocillos de muestra en el gel. El tampón se selecciona según el tipo de gel y las muestras que se utilicen.

Paso 2: preparar la muestra

A continuación, es el momento de preparar su muestra. Muchas personas analizan muestras de electroforesis en gel de acrilamida con un detergente llamado dodecil sulfato de sodio (SDS). Este detergente desnaturaliza las proteínas o altera su estructura tridimensional y las recubre con una carga negativa uniforme para una mejor migración a través del gel. Esto permite que las proteínas se separen según el peso, no el tamaño o las interacciones moleculares. Las muestras también se pueden procesar como un gel nativo, donde las proteínas no se desnaturalizan. Si se ejecuta con SDS, las muestras deben hervirse con SDS y un agente para romper los enlaces disulfuro, como 2-mercaptoetanol (BME). Por lo general, las muestras también incluyen una pequeña cantidad del tinte azul de Coomassie, que permite a los investigadores rastrear el movimiento de las proteínas a través del gel durante el experimento.

Paso 3: cargue las muestras

A continuación, las muestras deben cargarse en los pocillos con una pipeta. Además de las muestras, los científicos también ejecutan una escalera en el gel, que contiene proteínas de peso molecular conocido. Los científicos comparan qué tan lejos migró su muestra a la escalera para comprender qué tamaño de proteínas están presentes en su muestra.

Un investigador carga muestras en un gel de acrilamida.

Paso 4: Ejecute el Gel

Ahora es el momento de conectar los electrodos y encender la fuente de alimentación. La carga negativa que atraviesa el gel hace que las proteínas migren. Las proteínas más grandes se ven impedidas por la acrilamida y migran más lentamente en comparación con las proteínas más pequeñas. Los geles normalmente se ejecutan durante aproximadamente una hora, pero el tiempo de ejecución depende de las muestras y el tipo de gel utilizado.

La corriente eléctrica obliga a las proteínas a migrar a través del gel.

Análisis de resultados

Una vez que se ha corrido el gel, el primer paso es examinar las bandas. El tamaño de las proteínas presentes puede identificarse comparándolas con los tamaños conocidos de proteínas en la escalera. Pero el tamaño no siempre es suficiente. También queremos saber qué proteínas hay en la muestra. Para hacer esto, existen varias aplicaciones posteriores. El más común es una mancha occidental . Durante este procedimiento, las proteínas se transfieren a una membrana mediante electroforesis. Una vez que las proteínas se han adherido a la membrana, la membrana se incuba con una solución de anticuerpos que son específicos de la proteína en cuestión. Posteriormente, se aplica un anticuerpo secundario con una etiqueta de color. Esto revela la presencia o ausencia de la proteína deseada.

Un western blot usa anticuerpos para identificar proteínas

Las proteínas también se pueden aislar directamente del gel para su purificación. A partir de ahí, se puede obtener la estructura de la proteína, las propiedades de unión e información adicional.

Resumen de la lección

La electroforesis en gel de acrilamida es el proceso de separar moléculas, generalmente proteínas, a través de un gel de acrilamida. Para preparar el gel, se combinan acrilamida y bisacrilamida con un agente polimerizante como TEMED y APS. El gel de resolución en la parte inferior es típicamente un porcentaje más alto de acrilamida y el gel de apilamiento es un porcentaje más bajo en la parte superior. Las muestras, incluida una escalera conocida, se preparan y posiblemente se desnaturalizan usando SDS y BME y luego se cargan en el gel. La ejecución del gel separa las proteínas en función del tamaño y luego se puede utilizar para aplicaciones posteriores como la purificación de proteínas o la transferencia Western para identificar las proteínas presentes en la muestra.

Rodrigo Ricardo Editor y fundador