Ensayo de proteínas de Lowry: principio, protocolo y mecanismo

Principio del ensayo de proteínas de Lowry

Cuando los investigadores investigan los efectos de las enfermedades o la salud de un individuo, a menudo se prueba la concentración de proteínas del suero sanguíneo de un paciente. Se pueden usar varios métodos diferentes para probar la concentración de proteína. Uno de ellos es el ensayo de proteínas de Lowry , uno de los métodos más comunes utilizados para medir la concentración de proteína en una muestra.

El ensayo de proteínas de Lowry utiliza cobre, que se une a los enlaces peptídicos de las proteínas en condiciones alcalinas. Esto forma un ion de cobre monovalente que luego puede reaccionar con el reactivo de Folin, que a su vez puede reducirse a una sustancia de color azul. Este color azul se puede medir usando un espectrofotómetro para determinar la concentración de azul en la muestra. Por tanto, se puede determinar la concentración de proteína.

Pasos de la reacción

Repasemos los pasos de la reacción. Primero, es necesario preparar una norma. A menudo, se usa albúmina de suero bovino (BSA) como estándar. El estándar y la muestra siguen los pasos de la muestra para medir el contenido de proteína. Dado que se conoce el contenido de proteína de la BSA, se puede utilizar para convertir la absorbancia obtenida de la muestra en porcentaje de proteína en la muestra.

Entonces es necesario crear la solución Lowry. Consiste en una solución alcalina, sulfato de cobre y tartrato de sodio. Luego, la solución de Lowry se puede mezclar con la muestra. Esta mezcla debe incubarse durante 20 minutos para garantizar que se produzca la reacción. En este punto, la reacción es amarilla. A continuación se añade el reactivo de Folins y se vuelve a incubar la mezcla.

Cuando esta muestra se retire de la segunda incubación podremos ver un color azul si hubiera proteínas presentes en la muestra. La concentración de color azul se puede medir luego usando un espectrofotómetro. Normalmente se utilizará una longitud de onda de 750 nm, pero si se esperan concentraciones elevadas, se pueden utilizar 500 nm. Las concentraciones altas no funcionarán con una longitud de onda de 750 nm porque la absorción estará más allá de la capacidad de la máquina para leerla. La longitud de onda más baja es mejor para medir concentraciones altas porque mide una longitud de onda de luz que aparece en menor cantidad en la reacción. Cualquiera que sea la longitud de onda que se utilice, es necesario utilizar la misma tanto para el estándar como para la muestra.

Mecanismo de reacción

El cobre en la solución de Lowry es capaz de reaccionar con los enlaces peptídicos de la muestra para formar un enlace péptido-cobre. Cuando este enlace reacciona con los iones de hidróxido en el reactivo de Folins, el cobre se reduce a cobre (II). El compuesto de péptido de cobre (II) tiene un color azul.

El cobre puede unirse a los cuatro enlaces peptídicos porque tiene electrones adicionales y el nitrógeno-hidrógeno (NH) en el enlace peptídico tiene un orbital vacío.

El reactivo de Folins puede reducir el cobre porque el cobre prefiere estar en el estado 2+, por lo que los electrones pueden eliminarse fácilmente incluso con una base débil. Se desconoce el mecanismo exacto por el cual el reactivo de Folins reduce el cobre.

Resumen de la lección

El ensayo de proteínas de Lowry es uno de los métodos más comunes que se utilizan para medir la concentración de proteína en una muestra. Ocurre porque el cobre en el reactivo de Lowry puede reaccionar con enlaces peptídicos. Estos enlaces se hacen visibles cuando se reduce el cobre, porque forma una solución de color azul. La concentración de color azul se puede medir con un espectrofotómetro. Los pasos del ensayo de proteínas de Lowry son:

1. Prepare la solución de Lowry
2. Mezcle la solución Lowry con muestra o estándar
3. Incubar durante 20 minutos.
4. Agregar reactivo de Folins
5. Incubar
6. Mida la absorbancia a 750 nm o 500 nm para concentraciones más altas