Prueba de Bradford para Proteínas: Protocolo y métodos

¿Qué es el ensayo de Bradford?

¿Cómo saben las empresas qué contenido de proteínas deben incluir en sus etiquetas nutricionales? ¿Cómo pueden los científicos determinar la concentración de proteínas de las muestras que utilizarán en un experimento? Aunque parezca que se trata de un proceso difícil, es relativamente sencillo. De hecho, existen varios métodos de cuantificación de proteínas que los científicos, las empresas y los cursos de laboratorio universitarios utilizan para determinar la concentración de proteínas. Cada método tiene sus ventajas y desventajas, que deben sopesarse antes de seleccionar el ensayo que se utilizará.

El ensayo de proteínas de Bradford es uno de esos métodos de cuantificación de proteínas. El ensayo recibe su nombre del Dr. Marion Bradford, el científico que desarrolló el ensayo en 1976. Utilizó el colorante azul brillante de Coomassie G-250 porque existe en tres formas: cambia de color marrón rojizo a azul cuando las proteínas se unen a él. Una máquina llamada espectrómetro mide la absorbancia de las muestras a una longitud de onda de 595 nm, el punto óptimo entre la forma marrón rojiza (absorbancia máxima a 465 nm) y la forma azul (absorbancia máxima a 610 nm). Una mayor absorbancia indica una mayor concentración de proteínas, ya que hay más proteínas presentes para unirse al colorante, lo que provoca el cambio de color.

En general, el ensayo de proteínas de Bradford tiene muchas ventajas. En primer lugar, es un ensayo muy rápido. Los resultados se pueden obtener generalmente en tan solo cinco minutos. Además, es un ensayo muy fácil, ya que no requiere equipo especializado, aparte de un espectrómetro, y se puede realizar a temperatura ambiente. El reactivo del ensayo de Bradford es compatible con soluciones que contienen sales, iones metálicos, agentes reductores y quelantes, sustancias que se encuentran comúnmente en los tampones y se utilizan durante la preparación de la muestra. La principal desventaja es que el ensayo de Bradford no es compatible con detergentes. Por último, este ensayo es más eficiente para detectar proteínas grandes, lo que puede ser beneficioso o no, según las circunstancias.

¿Qué mide el ensayo de proteínas de Bradford?

En concreto, el colorante se une a los tres aminoácidos básicos: lisina, arginina e histidina. Esto pone de relieve otra limitación del ensayo de Bradford. Si las proteínas que se están midiendo están inusualmente enriquecidas o desprovistas de estos tres residuos, el ensayo sobreestimará o subestimará la concentración. Afortunadamente, la mayoría de las proteínas tienen un contenido relativamente similar de estos aminoácidos, por lo que en la mayoría de los casos, esto no afectará a los resultados. Dado que estos residuos básicos suelen tener una carga positiva, el ensayo de Bradford se realiza en condiciones ácidas. La forma doblemente protonada del colorante dona fácilmente un protón al residuo. Esto, a su vez, hace que la proteína se abra un poco, exponiendo más residuos y permitiendo que el colorante done su protón restante.

Ecuación y ejemplo de la curva estándar del ensayo de Bradford

Una vez que se han recolectado todas las absorbancias de las muestras y se ha verificado que se encuentran dentro del rango, se puede calcular la concentración de proteínas. Los pasos para determinar la concentración de proteínas de las muestras son los siguientes:

1. Grafique los valores de absorbancia de los estándares en un gráfico con el eje x representando la concentración y el eje y representando la absorbancia.
2. Calcule la ecuación de la curva estándar del ensayo de Bradford. Debe ser una línea bastante recta.
3. Opcional: reste el valor de absorbancia del estándar de 0 microgramos/microlitros de los valores de absorbancia de todas las muestras. Esto corrige el fondo y brinda un resultado más preciso. La absorbancia del estándar de 0 microgramos/microlitros debe ser muy cercana a 0.
4. Calcule la concentración de proteína de la muestra reemplazando el valor de absorbancia por y en la ecuación de la curva estándar y resolviendo x para cada muestra.

El siguiente ejemplo ilustra el proceso para calcular la ecuación de la curva estándar y la concentración de proteína de las muestras.

Esta tabla representa un conjunto de estándares y sus valores de absorbancia correspondientes. Después del paso 1, los puntos se trazan en un eje de coordenadas y se traza una línea a través de los puntos.

En este ejemplo, todos los puntos se encuentran sobre la línea, lo que facilita el cálculo de la curva estándar. La ecuación se escribirá en forma {eq}y = mx + b {/eq}. Para calcular m, la pendiente, se eligen dos puntos cualesquiera. Si se eligen los puntos {eq}(x1, y1) {/eq} y {eq}(x2, y2) {/eq}, entonces {eq}m = (y2 – y1)/(x2 – x1) {/eq}. En este ejemplo, se utilizarán los puntos {eq}(0, 0,02) {/eq} y {eq}(10, 0,22) {/eq}. Por lo tanto, {eq}m = (0,22 – 0,02) / (10 – 0) {/eq}. Por lo tanto, {eq}m = 0,02 {/eq}.

Una vez que se determina el valor de m, entonces cualquier punto puede introducirse en la ecuación para resolver b. Por ejemplo, si se elige el punto {eq}(x1, y1) {/eq}, al introducir los valores se obtiene la ecuación {eq}y1 = m(x1) + b. {/eq} Al resolver b se obtiene la ecuación {eq}b = y1 – m(x1) {/eq}. Usando el punto {eq}(0, 0.02) {/eq}, {eq}b = 0.02 – 0.02(0). {/eq} Entonces, {eq}b = 0.02 {/eq}. Con los valores de m y b ahora determinados, se vuelven a introducir en {eq}y = mx + b {/eq}. La ecuación de la curva estándar es {eq}y = 0.02x + 0.02 {/eq}.

Ahora, se pueden calcular las concentraciones de proteína para las muestras. Para ilustrar cómo se hace esto, supongamos que se analizó una muestra sin dilución y con una dilución de 1:25. La absorbancia para la muestra sin dilución fue 1,5. Esto está fuera del rango de los estándares. Afortunadamente, la dilución 1:25 tuvo una absorbancia de 0,16. Esto está dentro del rango y se puede utilizar para calcular la concentración de la muestra. Recuerde que la absorbancia es el valor y en el gráfico, por lo que al resolver x se revelará la concentración de proteína.

Utilizando la ecuación de las curvas estándar, al despejar x se obtiene la ecuación {eq}x = (y – 0,02)/0,02 {/eq}. Por lo tanto, en este ejemplo, {eq}x = (0,16 – 0,02)/0,02 {/eq}. Por lo tanto, la concentración de proteína en esta muestra es de 7 microgramos/microlitro. Sin embargo, como esta absorbancia se obtuvo después de una dilución de 1:25, es necesario multiplicar la concentración calculada por 25. Esto significa que la concentración de proteína real de la muestra es de 175 microgramos/microlitro.

A menudo, el gráfico de los estándares no dará como resultado una curva estándar en la que los valores caigan sobre una línea. En este caso, es mejor trazar los puntos en Excel o en algún otro programa gráfico y aprovechar la función que determina la línea de mejor ajuste y muestra su ecuación.

Resumen de la lección

El ensayo de proteínas de Bradford es uno de los diversos métodos de cuantificación de proteínas. El ensayo utiliza el colorante azul brillante de Coomassie G-250 y mide la absorbancia a 595 nm. En condiciones ácidas, el colorante cambia de marrón rojizo a azul cuando interactúa con las proteínas. Específicamente, el colorante interactúa con lisina, histidina y arginina, los aminoácidos básicos. La absorbancia aumenta a medida que aumenta la concentración de proteínas.

La concentración de muestras desconocidas se calcula utilizando una curva estándar obtenida al representar gráficamente la absorbancia de un conjunto de estándares de concentraciones de proteínas conocidas. La albúmina sérica bovina (BSA) es la proteína que se utiliza con más frecuencia en estos estándares. La ecuación de la curva estándar del ensayo de Bradford se utiliza para calcular las concentraciones de proteínas introduciendo los valores de absorbancia de las muestras y despejando x.

Rodrigo Ricardo Editor y fundador