Inmunohistoquímica: Definición, usos, tinciones y protocolos

¿Qué es la inmunohistoquímica?

¿Alguna vez te has cortado y has decidido limpiarlo con peróxido? ¿Qué sucedió? Si pudiera ver más allá de la dolorosa sensación de ardor, probablemente también notó que el peróxido burbujea cuando lo coloca en su corte abierto. ¿Porqué es eso? Pequeñas proteínas llamadas enzimas dentro de la piel transforman el peróxido en agua y gas oxígeno, lo que crea las burbujas. Algunas bacterias carecen de estas enzimas y, por lo tanto, el peróxido tóxico las mata y deja las células intactas, esterilizando el corte.

Hay miles de enzimas dentro de nuestras células, pero los seres humanos también han encontrado un uso para las enzimas en biología molecular. Durante un proceso llamado inmunohistoquímica, las células o muestras de tejido se tiñen con anticuerpos unidos a enzimas. Cuando se agrega un sustrato para la enzima, las enzimas catalizan una reacción química que causa un cambio de color que se puede ver con el microscopio. Esto permite a los científicos detectar la presencia de ciertas proteínas en una muestra.

Usos

Entonces, ¿de qué sirve esta tecnología? ¿Por qué querríamos mirar algo tan pequeño como la proteína? Las proteínas son los componentes básicos de la célula. Mantienen la célula unida, crean estructuras internas, lo que permite el movimiento, la división celular y llevan a cabo todas las demás funciones de la célula. Los cambios en la estructura o función de las proteínas son una de las características distintivas de muchas enfermedades.

Por ejemplo, durante la enfermedad de Alzheimer, una proteína llamada beta amiloide se acumula en el tejido cerebral, lo que se puede ver mediante inmunohistoquímica. Los cambios en la expresión de las proteínas pueden ayudar a los científicos a comprender lo que está sucediendo durante la progresión de la enfermedad, brindándoles vías a seguir para encontrar tratamientos.

La inmunohistoquímica también es útil para diagnosticar la progresión de tumores cancerosos. Los tumores tienden a desarrollar ciertos marcadores de proteínas a medida que se vuelven más malignos. La inmunohistoquímica puede detectar estos cambios en las proteínas y también indicar de qué tipo de tejido proviene originalmente el tumor y a qué tratamientos pueden responder.

La inmunohistoquímica también tiene otras aplicaciones, como la identificación de un patógeno durante una infección mediante la búsqueda de proteínas asociadas con ese patógeno en particular, la detección de traumatismos cerebrales e identificación de pacientes con trastornos musculares hereditarios mediante la detección de la presencia de una variante de proteína en particular.

Manchas

Hay dos tinciones principales que se utilizan en inmunohistoquímica basada en enzimas, peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina. Las moléculas fluorescentes también se pueden utilizar durante un procedimiento de inmunohistoquímica especializado llamado inmunofluorescencia.

1. La peroxidasa de rábano picante es una enzima que convierte un sustrato incoloro en un producto coloreado en presencia de peróxido de hidrógeno. El producto coloreado precipita cerca del anticuerpo, que se puede ver al microscopio, lo que indica la presencia de la proteína. Diferentes sustratos producen productos de diferentes colores. La 3,3′-diaminobencidina (DAB) se usa comúnmente y produce un producto rojo.
   
   Un tumor de cáncer de mama teñido con peroxidasa de rábano picante en marrón y teñido con colorante azul para visualizar todas las células
2. De manera similar, la fosfatasa alcalina es una enzima que convierte un sustrato incoloro en un producto coloreado que precipita y se une al tejido donde se encuentra el anticuerpo. La fosfatasa alcalina se usa típicamente con nitroazul de tetrazolio (NBT), que produce un precipitado azul.

Protocolo

1. Arreglar

El primer paso es utilizar un fijador como el formaldehído para preservar el tejido. Esto evita que el tejido se descomponga y mantiene la estructura celular.

2. Sección y montaje

Una vez fijado el tejido, la mayoría de las muestras de tejido se incrustan en cera de parafina para preservar la arquitectura del tejido. Una vez que las muestras se incrustan en parafina, se pueden seccionar para montarlas en portaobjetos de vidrio que se pueden ver con un microscopio.

3. Desparafinización y recuperación de antígenos

Aunque la parafina es útil para mantener la integridad estructural durante el corte, interfiere con la unión del anticuerpo durante la inmunohistoquímica. Por lo tanto, el siguiente paso es la desparafinización en la que se elimina la parafina de las muestras mediante un tratamiento químico, generalmente xileno. El fijador también puede bloquear los sitios de unión del anticuerpo y debe eliminarse utilizando sustancias químicas adicionales en un proceso llamado recuperación de antígeno .

4. Bloquear

Las enzimas del rábano picante y la fosfatasa alcalina se encuentran naturalmente en los tejidos y, por lo tanto, su actividad debe apagarse antes de comenzar el procedimiento de tinción incubando la muestra con peróxido de hidrógeno para muestras de peroxidasa de rábano picante o levamisol para muestras de fosfatasa alcalina.

También se realiza un bloqueo físico adicional para evitar la unión no específica incubando las muestras con leche baja en grasa o albúmina de suero bovino. Estas proteínas se unen a proteínas de la muestra que pueden producir una unión no específica del anticuerpo primario o secundario.

5. Aplicación de anticuerpos

Ahora la muestra está lista para el anticuerpo. Los anticuerpos primarios se unen al objetivo en el que están interesados ​​los científicos. Esto se puede hacer en unas pocas horas o durante la noche, según el anticuerpo. Después de la tinción del anticuerpo primario, las muestras se lavan en tampón y se aplica el anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario se adhiere al anticuerpo primario y contiene la enzima necesaria para el cambio de color. El uso de dos anticuerpos ayuda a aumentar la sensibilidad del procedimiento, llamado inmunohistoquímica indirecta . Las muestras generalmente se incuban con el anticuerpo secundario durante una o dos horas.

6. Aplicación del sustrato

Ahora, los portaobjetos están listos para agregar el sustrato. El sustrato debe aplicarse a los portaobjetos y la reacción debe monitorearse bajo un microscopio. Cuando se haya producido el cambio de color deseado, los científicos detendrán la reacción lavando los portaobjetos con tampón. ¡Ahora están listos para el análisis!

Resumen de la lección

La inmunohistoquímica se utiliza para identificar proteínas específicas en tejidos mediante enzimas unidas a anticuerpos que producen un cambio de color cuando entran en contacto con un sustrato. Normalmente se utilizan dos tinciones enzimáticas , peroxidasa de rábano picante , que produce una mancha roja, y fosfatasa alcalina , que normalmente produce una mancha azul.

Las muestras de tejido deben conservarse en fijador , y luego incrustarlas en parafina. Luego, las muestras deben seccionarse y luego tomarse mediante desparafinización para eliminar la parafina y luego tratarse con productos químicos para desbloquear los sitios de unión del anticuerpo durante la recuperación del antígeno . Luego, las muestras se bloquean para evitar la unión no específica y se incuban con anticuerpos primarios y secundarios. Se aplica el sustrato y luego los científicos observan un cambio de color.