Principios Básicos de Técnicas Moleculares en Química Clínica

¿Qué es el diagnóstico molecular?

El diagnóstico molecular generalmente se refiere a la detección o análisis de moléculas de ácido nucleico (ADN o ARN) o proteínas específicas en muestras clínicas. La información proporcionada por el diagnóstico molecular se utiliza para detectar patógenos y analizar genes de pacientes que conducen al tratamiento de enfermedades infecciosas o trastornos genéticos. Las fuentes de muestra más comunes son la sangre o el tejido del paciente.

Durante un tiempo, el único medio de detectar patógenos era mediante el cultivo de muestras, pero este método consumía mucho tiempo y era peligroso para los técnicos de laboratorio. En las últimas décadas, el diagnóstico molecular ha avanzado hacia los cinco métodos que se tratan en esta lección:

• Transferencia occidental
• Ensayo ELISA
• Microarrays
• PCR
• Secuenciación de próxima generación

Transferencia occidental

Las transferencias Western se utilizan para separar y cuantificar proteínas diana por peso molecular utilizando electricidad. Fueron inventados en 1979 para la investigación del ARN ribosomal, pero con el tiempo se han utilizado en diagnóstico molecular. Aunque son menos comunes en los laboratorios médicos, las transferencias Southern y Northern utilizan métodos similares a los Western blots para separar el ADN y el ARN, respectivamente, generalmente por la longitud de la cadena. Los tres pasos para secar son:

• Separación de proteínas desnaturalizadas por tamaño mediante electroforesis en gel
• Transferencia de proteínas a un soporte sólido.
• Etiquetado de proteínas diana utilizando anticuerpos primarios y secundarios

Las transferencias Western se utilizan normalmente para confirmar un diagnóstico de VIH o enfermedad de Lyme mediante la búsqueda de anticuerpos contra estas enfermedades. Utilizado en combinación con ELISA, los resultados positivos tienen una precisión del 99,9%. Sin embargo, los anticuerpos de una infección específica pueden tardar meses en activar el sistema inmunológico y crear anticuerpos, por lo que una prueba Western blot realizada demasiado pronto puede producir falsos negativos. Los avances recientes en el diagnóstico molecular han producido métodos de prueba más rápidos y precisos; en 2014 y 2019, los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) recomendaron otros para el diagnóstico del VIH y la enfermedad de Lyme, respectivamente. Sin embargo, estas pruebas todavía se realizan de forma rutinaria en laboratorios de todo el país.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) son un grupo de pruebas que se utilizan para detectar y cuantificar anticuerpos, antígenos, proteínas, glicoproteínas y hormonas en una muestra. Se considera el estándar de oro de los inmunoensayos. Suelen realizarse en una placa con múltiples pocillos. La prueba utiliza la reacción química anticuerpo-antígeno para identificar una variedad de moléculas. Los ELISA se utilizan con mayor frecuencia para pruebas de embarazo, tipificación sanguínea y diagnóstico de enfermedades como el VIH y también para encontrar marcadores tumorales, determinar exposiciones pasadas a antígenos y detectar abuso de drogas. Cuatro tipos principales de ELISA utilizan métodos ligeramente diferentes para detectar moléculas específicas en una muestra.

• Los ELISA directos utilizan un anticuerpo para unirse directamente a la proteína objetivo. Estas pruebas son más rápidas y tienen menos posibilidades de que interactúen los anticuerpos secundarios. Sin embargo, es menos sensible y cuesta más que los otros tipos.
• Los ELISA indirectos utilizan dos anticuerpos diferentes en su reacción. El anticuerpo primario se adhiere a la molécula objetivo y un anticuerpo secundario se une al anticuerpo primario. Esto permite una mayor sensibilidad en los resultados de las pruebas y es más flexible y menos costoso que los ELISA directos. Existe riesgo de reactividad cruzada de anticuerpos secundarios.
• Los ELISA sándwich utilizan pocillos en una placa recubierta con anticuerpos que se unirán a proteínas específicas en la muestra antes de agregar un anticuerpo secundario para unirse a la proteína creando un sándwich de anticuerpos. Este es el ELISA de mayor sensibilidad, pero también es el que requiere más tiempo y es más caro.
• Los ELISA competitivos prueban anticuerpos para un antígeno específico en la muestra mediante la introducción de antígenos y anticuerpos especiales en los pocillos. Si el paciente tiene anticuerpos para el antígeno en la sangre, sus anticuerpos se unirán, no los anticuerpos de prueba agregados más adelante en el proceso, y no se producirá ningún cambio de color. Si los anticuerpos de la prueba especial se unen al antígeno porque la muestra no tiene esos anticuerpos, entonces se produce un cambio de color en el pocillo. Este tipo de ELISA requiere una muestra de alta concentración y tiene menor especificidad. Los beneficios de este tipo de ELISA son que puede medir una amplia gama de antígenos, incluso antígenos pequeños, y tiene baja variabilidad.

Microarrays

Los microarrays pueden detectar moléculas como ADN, ARN, miARN y proteínas porque pueden utilizar diferentes interacciones entre moléculas, incluido el emparejamiento de bases complementarias, reacciones antígeno-anticuerpo y la interacción de carbohidratos con lectinas. Se utilizan principalmente para la identificación rápida y específica de organismos patógenos, lo que permite analizar una sola muestra para detectar hasta 12 especies patógenas comunes a la vez. Se han creado algunos microarrays para buscar cosas como marcadores genéticos que muestran riesgos de metástasis de cáncer de mama, enfermedades cardíacas y otras enfermedades genéticas. Esta tecnología es muy complicada y existe un gran riesgo de contaminación durante los pasos, lo que los hace menos comunes en medicina de diagnóstico que en investigación médica. En el futuro, los avances que permitan procesar microarrays en un solo paso pueden hacer que estén más fácilmente disponibles para la medicina de diagnóstico.

Reacción en cadena de la polimerasa

Las pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizan para replicar y amplificar pequeñas cantidades de ADN o ARN y luego se utilizan para identificar enfermedades infecciosas o trastornos genéticos. Esto facilita la detección de pequeñas cantidades de material genético anormal y elimina la necesidad de cultivar patógenos. Se utiliza principalmente como prueba para determinar la paternidad, diagnosticar enfermedades infecciosas, diagnosticar mutaciones genéticas e incluso detectar células cancerosas en una muestra. Utiliza la maquinaria que ya se encuentra en nuestras células para replicar el ADN o el ARN, pero agregar un cebador específico a la muestra puede amplificar una sección específica del genoma. Hay tres tipos de PCR y cada uno tiene diferentes funciones de diagnóstico:

• PCR: detecta y amplifica el ADN en una muestra.
• rtPCR: detecta y amplifica el ARN en una muestra
• qPCR: puede medir la cantidad de patógenos en una muestra (se puede usar con otros tipos de pruebas de PCR)

Secuenciación de próxima generación

La secuenciación de próxima generación (NGS), también llamada secuenciación de alto rendimiento, es un grupo de tecnologías de secuenciación lo suficientemente específicas como para detectar mutaciones de un solo nucleótido y secuenciar rápidamente un genoma completo. Se considera el estándar de oro para el diagnóstico de trastornos genéticos debido a su precisión, gran capacidad de volumen y rentabilidad. NGS se diferencia de la secuenciación de Sanger, el estándar utilizado anteriormente, al modificar todas las bases agregadas para el alargamiento durante la secuenciación y al utilizar separación posicional con fluorescencia para secuenciar ADN o ARN. Esta tecnología puede eventualmente reemplazar los microarrays y tecnologías similares porque no se limita a lo que se puede detectar sino que, en cambio, puede secuenciar y conducir a la identificación de patógenos y trastornos genéticos de forma rápida y económica.

Resumen de la lección

En el diagnóstico molecular, la detección de proteínas, ARN, ADN u otros ácidos nucleicos se utiliza para diagnosticar enfermedades infecciosas o trastornos genéticos. Las transferencias Western se utilizan para separar proteínas por tamaño o peso molecular mediante electricidad. En segundo lugar, los inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA) utilizan la relación de unión antígeno-anticuerpo para identificar proteínas, anticuerpos, glicoproteínas u hormonas. Muchos tipos de ELISA utilizan diferentes patrones de unión y tienen ventajas y desventajas. En tercer lugar, los microarrays son pruebas que utilizan placas con pocillos para detectar ADN, ARN, miARN y proteínas. Utilizan un método complicado con muchos pasos que los hacen menos comunes en la medicina de diagnóstico, pero algunas pruebas pueden usar una sola muestra para detectar hasta 12 enfermedades patógenas, lo que las hace muy informativas. Cuarto, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un proceso que amplifica pequeñas cantidades de ADN o ARN para detectar patógenos o enfermedades genéticas. Ayudan a eliminar la necesidad de cultivar patógenos peligrosos o no cultivables y proporcionan resultados más rápidos que los métodos utilizados anteriormente. Por último, la secuenciación de próxima generación (NGS) es una tecnología diferente que se utiliza para secuenciar ADN o ARN de forma rápida y precisa. Son el estándar de oro para la secuenciación de ácidos nucleicos y se están convirtiendo en la forma más fiable de diagnosticar enfermedades genéticas. Todos estos métodos se utilizan actualmente en los laboratorios para diagnosticar enfermedades infecciosas y trastornos genéticos.

Rodrigo Ricardo Editor y fundador