Pruebas de Proteínas: Tipos, extracción y manipulación

¿Por qué realizar pruebas de proteínas?

Las proteínas del cuerpo humano vienen en diferentes tamaños y formas, pero todas son partes esenciales de los músculos, el cabello y casi todos los demás tejidos del cuerpo. También sirven como catalizadores en reacciones metabólicas y como transportadores y soportes estructurales. Los aminoácidos son pequeños monómeros, los componentes básicos de las proteínas más grandes que sirven como macromoléculas poliméricas complejas. Sin embargo, también existen ácidos nucleicos, que son polímeros de nucleótidos que transportan información genética. Las pruebas de estas diversas proteínas se realizan tanto con fines clínicos como de investigación. En el ámbito clínico, las proteínas se analizan para diagnosticar anomalías genéticas y del metabolismo de los aminoácidos.

Tipos de muestras y pruebas de proteínas

Hay muchas formas de comprobar la presencia de una proteína o la cantidad de ella que se encuentra en el cuerpo. Las pruebas de proteínas grandes son bastante simples, pero cuando analizamos proteínas más pequeñas, como aminoácidos y ácidos nucleicos, entran en juego las técnicas más complejas de la biología molecular. La biología molecular es el estudio de los procesos y estructuras químicos a nivel molecular.

Extracción de ADN

La extracción de ADN se utiliza para aislar ácido desoxirribonucleico (ADN) de diversas estructuras proteicas (como membranas celulares) mediante procesos físicos o químicos. Se puede realizar como primer paso hacia un proceso más largo de biología molecular de algún tipo o en diversas aplicaciones como la toma de huellas dactilares o la secuenciación genética. La extracción de ADN implica tres pasos básicos, que son:

• Lisis: en este paso, las células de la muestra se abren utilizando varios detergentes y enzimas para liberar el ADN.
• Precipitación: el ADN liberado se precipita de los restos celulares. Esto se hace usando sodio para neutralizar cualquier carga en la molécula de ADN y luego alcohol para provocar la precipitación.
• Purificación: el ADN precipitado se enjuaga con alcohol para eliminar todos los restos restantes.

Pruebas de amplificación de ácidos nucleicos

Las bacterias, los virus y el ADN son muy, muy pequeños, e identificarlos o cuantificarlos en una muestra de fluido corporal puede ser un desafío. Las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) son técnicas de biología molecular que amplifican la señal de los ácidos nucleicos que componen estas moléculas en una muestra para que sea más fácil identificarlos. Esto se hace iniciando diversas reacciones químicas para realizar copias del ADN o ARN que se van a identificar.

Un ejemplo de NAAT utilizada en aplicaciones forenses, en genética y para diagnosticar enfermedades infecciosas es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). PCR se basa en un proceso en el que hay tres pasos principales:

• Desnaturalización: el ADN bicatenario se calienta hasta que se funde y forma dos hebras simples.
• Recocido: cebadores que se han elegido para recocer las hebras individuales o plantillas que se van a copiar. Luego, la enzima polimerasa se adhiere a esta plantilla recocida para comenzar a copiarla.
• Extensión: la plantilla continúa copiándose, creando grandes cantidades de moléculas de ADN.

Cromatografía líquida/espectrometría de masas

La cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS) es una técnica analítica utilizada para identificar y cuantificar diversas proteínas. Combina las técnicas de cromatografía líquida, en la que los componentes de una muestra se separan y concentran, con la espectrometría de masas, en la que los iones de la muestra se separan según su relación masa-carga (m/z). Los cuadrupolos, varillas de electrodos dispuestas de una manera particular, filtran los iones de las moléculas que deben identificarse fuera de la muestra. Esta técnica se utiliza a menudo en toxicología, análisis de fármacos y medicina forense.

Recolección de muestras y requisitos de las muestras

Se pueden analizar sangre, saliva, orina, líquido cefalorraquídeo, muestras forenses y otros para detectar proteínas y compuestos nitrogenados. El tipo de método de muestreo depende del tipo de información que se busca y del tipo de prueba que se realiza.

• El ADN se puede extraer de sangre, muestras de tejido o semen.
• El muestreo bucal, o el muestreo del área interna de la mejilla, se utiliza a menudo en medicina forense.
• Para recolectar muestras de virus como el COVID-19, se realiza un hisopo nasal para la prueba de PCR.
• Se necesita una muestra de orina para detectar proteínas eliminadas por los riñones.

La sangre es el tipo más común de muestra recolectada en un entorno de investigación como fuente de ADN o ARN. Se necesitan alrededor de 3 a 5 ml y se extrae con un tubo de sangre Vacutainer con tapa de color lavanda y EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). El EDTA es un anticoagulante que previene la coagulación.

Manipulación, envío y almacenamiento

Las muestras de sangre recolectadas como fuente de ADN o ARN pueden mantenerse refrigeradas por hasta 24 horas a 4°C o congeladas a -80°C para un período de almacenamiento más prolongado. Las muestras pueden almacenarse en nitrógeno líquido si se desea una viabilidad a largo plazo. La centrifugación necesaria para cualquier muestra clínica de plasma debe completarse inmediatamente para evitar que otros componentes sanguíneos afecten a los aminoácidos. Después de la centrifugación, las muestras de plasma deben mantenerse congeladas (-70°C) hasta su análisis. Si se envían durante la noche, las muestras deben envasarse en hielo seco.

Las muestras de saliva se pueden almacenar hasta una semana a 4°C, pero si se necesita un almacenamiento más prolongado, se pueden congelar a -20°C por hasta 4 meses y a -80°C por más tiempo. Todo el personal del laboratorio debe estar adecuadamente capacitado en el manejo y almacenamiento adecuados de este tipo de muestras.

Resumen de la lección

Los aminoácidos son monómeros y los componentes básicos de proteínas más grandes. Los ácidos nucleicos son polímeros que transportan información genética. Ambos se prueban a menudo mediante biología molecular, el estudio de procesos químicos a nivel molecular. Los tipos de pruebas para estas proteínas incluyen:

• La extracción de ADN aísla el ADN de varias estructuras proteicas mediante procesos químicos y físicos. Implica tres pasos: lisis para abrir las células, precipitación para extraerlas de los desechos celulares y purificación o enjuague.
• Las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) amplifican la señal de los ácidos nucleicos multiplicando su número hasta que sean más fáciles de identificar en la muestra. Un ejemplo comúnmente utilizado es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que consiste en desnaturalización (separación de cadenas de ADN), hibridación (unión del cebador a la plantilla) y extensión (la reacción continúa, copiando el ADN).
• La cromatografía líquida/espectrometría de masas combina la cromatografía líquida con la espectrometría de masas, utilizando cuadrupolos, varillas de electrodos que filtran los iones por carga.

Se pueden usar muestras de sangre, fluidos corporales o tejido para realizar pruebas de proteínas, pero la sangre es el tipo de muestra más común que se usa para las pruebas de ácido nucleico en la investigación. Las muestras guardadas para un almacenamiento prolongado a menudo deben congelarse a temperaturas específicas.

Rodrigo Ricardo Editor y fundador