¿Qué es la Prueba de Ames? Explicación, propósito y limitaciones

Prueba de Ames

La prueba de Ames es un bioensayo bacteriano in vitro para identificar sustancias que causan mutaciones genéticas. Varios compuestos y medicamentos son mutágenos o cancerígenos. La prueba de Ames se utiliza para investigar los compuestos que son mutágenos potenciales que pueden causar mutaciones genéticas.

El método fue desarrollado y estandarizado por Bruce Ames en 1975. El ensayo implica la inducción de una nueva mutación y la reversión de la anterior. La prueba de Ames también se conoce como ensayo de reversión, ya que implica la reversión de las bacterias mutantes. El principio del ensayo se basa en la reversión de la mutación de histidina (His) de la bacteria Salmonella typhimurium. La mutación en el operón His desactiva la enzima necesaria para la síntesis del aminoácido esencial, la histidina. La cepa de Salmonella con mutaciones His es auxótrofa de histidina, lo que significa que no pueden crecer en el medio sin histidina. Sin embargo, los revertantes restauran la enzima sintetizadora de histidina debido a compuestos mutagénicos y pueden crecer en placas sin histidina.

Mutágenos y carcinógenos

El ADN es la molécula que almacena nuestra información genética. El ADN consta de nucleótidos en el código de tres. Estos códigos se transcriben con codones complementarios durante la transcripción. Estos codones codifican aminoácidos específicos que forman una proteína. Cualquier cambio o mutación en los codones puede conducir a la formación de proteínas incorrectas. Los errores en el ADN se llaman mutaciones. Las mutaciones pueden surgir espontáneamente debido a errores durante la replicación del ADN, pueden ser hereditarias o ocurrir cuando las células encuentran mutágenos.

Los mutágenos son sustancias que inducen daño genético hereditario o pueden aumentar la incidencia de mutación (daño genético). Los mutágenos provocan cambios en genes importantes, como inserción, eliminación o sustitución incorrectas, que cambian la información genética y dan como resultado una mutación. Los mutágenos pueden ser endógenos, o afectan desde el interior del cuerpo, o exógenos, que afectan desde fuera del cuerpo. Varios compuestos mutagénicos conducen a la mutación de genes responsables del crecimiento celular controlado. En tales condiciones, las células se dividen de forma incontrolada y provocan cáncer. Estos compuestos que causan cáncer son carcinógenos.

Los carcinógenos son agentes químicos, biológicos o físicos que se sabe o se sospecha que causan un crecimiento descontrolado de células que provocan cáncer. Causan cáncer cuando el cuerpo los ingiere, los inhala o los absorbe.

Tanto los mutágenos como los carcinógenos pueden provocar cambios en el funcionamiento normal de las células y pueden ser físicos, químicos o biológicos. La mayoría de los mutágenos pueden ser carcinógenos y provocar cambios en el funcionamiento de las células que provocan cáncer. Sin embargo, no todos los carcinógenos son mutágenos.

Ejemplos de mutágenos y carcinógenos incluyen los siguientes:

Mutágenos

• Mutágenos endógenos como las especies reactivas de oxígeno (ROS).
• Radiación ultravioleta
• Virus
• Elementos radiactivos
• Productos químicos como bromuro de etidio y 5-bromouracilo.

Carcinógenos

• Radiaciones
• Peligros ambientales como agua, suelo y aire contaminados.
• Productos químicos y humo de cigarrillos.
• Amianto
• Carcinógenos químicos como nitrosaminas, colorantes azoicos, pesticidas y carbamatos.

Prueba de Ames

La prueba de Ames es un bioensayo que se utiliza para determinar mutágenos potenciales. En este bioensayo se utiliza una cepa mutante de Salmonella. En su operón de histidina, la cepa mutante tiene una mutación puntual. Como resultado, la cepa no puede sintetizar histidina por sí sola. El crecimiento en placas de crecimiento requiere la adición de histidina a las placas. Esta cepa mutante es muy susceptible a las mutaciones y es más permeable a las sustancias químicas en comparación con la cepa salvaje. Para sobrevivir, la cepa mutante debería revertir la mutación y recuperar su capacidad para sintetizar histidina. La presencia de sustancias químicas con posibles propiedades mutagénicas induce la reversibilidad de la mutación. Las cepas de Salmonella se manejan en Bio-Safety Labs (BSL-2). El ensayo requiere control positivo y negativo para la correcta evaluación de los resultados. El control positivo utiliza un mutágeno conocido, la azida sódica. Se sabe que este mutágeno causa una retromutación en la cepa. Para el control negativo, se utiliza agua en lugar del compuesto de prueba.

Los pasos involucrados en la prueba de Ames son los siguientes:

• Una semana antes se preparan placas de agar mínima glucosa que contienen agar, solución salina, glucosa y sales. Este medio contiene menos cantidad de histidina para promover el crecimiento inicial de las bacterias.
• Se cultivó una suspensión de cultivo de la cepa TA100 de Salmonella typhimurium en agar Mueller-Hinton.
• La suspensión equivalente a 10⁸ufc/ml se prepara en una solución estéril.
• Las cepas se exponen a los compuestos químicos problema durante 20 minutos y luego se vierte la suspensión en placas de agar con un mínimo de glucosa. Prepare una suspensión de control similar sin sustancias problema.
• Las placas vertidas se incuban durante 48 horas a 37°C.
• Las placas se revisan en busca de colonias después de 48 horas. Las colonias son una población visible de bacterias que crece como un solo grupo de bacterias en la placa de crecimiento.

Un número elevado de colonias en placas de prueba con bacterias tratadas químicamente en comparación con las placas de control (placas sin productos químicos) indica propiedades mutagénicas del compuesto químico. Esto se debe a que el compuesto mutagénico revierte sus cepas dependientes. Por tanto, pueden crecer en placas con un mínimo de histidina.

Si la placa de prueba no contiene colonias o contiene pocas colonias equivalentes a las de la placa de control, indica que el compuesto químico problema no es mutagénico.

Actualmente, ha habido muchos avances en la realización del test de Ames. Las placas MicroTiter se utilizan para la determinación de revertentes.

Propósito de la prueba de Ames

Nuestro medio ambiente es una fuente común de diferentes carcinógenos. Esto incluye aire, agua y suelo contaminados, aditivos alimentarios, agentes aromatizantes y pesticidas. Aparte de esto, varios fármacos potenciales también pueden contener componentes cancerígenos. Alrededor del 90% de los carcinógenos son mutágenos. Es importante investigar las propiedades mutagénicas de los compuestos que se encuentran comúnmente para alertar y educar a las personas sobre su uso y las precauciones necesarias. El propósito de la prueba de Ames es detectar sustancias químicas por sus propiedades mutagénicas. Es un ensayo sencillo, económico y rápido para determinar compuestos cancerígenos. La prueba desempeña un papel importante en el proceso de descubrimiento de fármacos, ya que proporciona información vital sobre la carcinogenicidad de diferentes compuestos diseñados como fármacos potenciales.

Los estudios muestran que el 90% de los mutágenos detectados por la prueba de Ames son potentes carcinógenos. La prueba fue estudiada por su especificidad y sensibilidad antes de proponerla a la EPA de EE. UU. Los primeros informes sobre la sensibilidad y la especificidad rondaron el 90% y el 75% respectivamente. Sin embargo, estos primeros estudios generalmente utilizaron altas concentraciones de agentes alquilantes directos, nitrosaminas e hidrocarburos aromáticos policíclicos. Los estudios posteriores utilizaron sustancias químicas que debían metabolizarse para producir una molécula mutagénica, como sustancias químicas cloradas y ftalatos. Esto resultó en una reducción de los índices de sensibilidad y especificidad de la prueba, pero no cambió el valor predictivo positivo (90%) de carcinogenicidad. De varias pruebas de toxicidad, la prueba de Ames tiene la mayor cantidad de datos y ha mostrado altos índices de éxito y reproducibilidad.

La prueba de Ames ha identificado propiedades mutagénicas de varios productos de uso común como tris (2,3-dibromopropil) fosfato, furilfuramida, naranja de acridina, bencidina, cloruro de vinilo y mostaza de uracilo.

Limitaciones de la prueba de Ames

Aunque la prueba es muy sólida y sencilla, existen limitaciones. Los informes de estudios en animales muestran que algunas sustancias químicas como la dioxina causan cáncer en animales, pero muestran resultados negativos en la prueba de Ames. Otra limitación de la prueba es que se basa en un sistema bacteriano, lo que no es un buen modelo para humanos. Cuando ciertas sustancias químicas se metabolizan en el cuerpo humano, pueden transformarse de no mutágenos a mutágenos. Para algunos compuestos, se utiliza la fracción de hígado de rata para imitar el metabolismo de los mamíferos. El uso de enzimas del hígado de rata permite que el compuesto de prueba reaccione con ellas y se convierta en un mutágeno, tal como lo hace en los cuerpos humanos. Sin embargo, se han observado varias diferencias en el metabolismo de humanos y ratas.

Resumen de la lección

La prueba de Ames es un bioensayo simple para determinar compuestos mutagénicos. Nuestro medio ambiente está plagado de sustancias químicas que pueden ser mutagénicas. Varias moléculas de fármacos nuevos tienen el potencial de ser mutagénicas. Aproximadamente el 90% de los mutágenos son carcinógenos con potencial para causar cáncer. La detección de mutagenicidad en compuestos es una parte importante del desarrollo de nuevos fármacos y la difusión de información sobre seguridad. La prueba de Ames emplea una cepa mutante de Salmonella typhimurium. Esta bacteria no puede producir por sí sola el aminoácido histidina. La prueba implica tratar las bacterias con un compuesto de prueba, colocarlas en medios con un mínimo de glucosa sin histidina y observar el crecimiento de las colonias.

Las colonias bacterianas son una población visible que crece en las placas como una sola bacteria. Después de realizar la prueba de Ames, las placas de prueba con pocas colonias indican que el compuesto de prueba no causó ninguna mutación y no es un mutágeno. La prueba tiene varias limitaciones, incluido el uso de una cepa bacteriana que no es un buen modelo humano. Para abordar esto, la prueba de Ames emplea enzimas del hígado de rata que hacen que la molécula de prueba se vuelva mutagénica, simulando el proceso que ocurre en los cuerpos humanos.

Rodrigo Ricardo Editor y fundador