Reacción en cadena de la ligasa: definición y procedimientos

Reacción en cadena de la ligasa

¿Alguna vez has comido una pequeña cantidad de algo que realmente te gusta? ¿No te hubiera gustado poder hacer más rápidamente? ¿Y si pudieras encontrar una manera de magnificarlo? Esta es la base de una técnica que utilizan los científicos para crear más ADN en un laboratorio. La reacción en cadena de ligasa , o LCR para abreviar, es una técnica que amplifica la cantidad de sondas de ADN. Como saben, el ADN es de doble hebra y está conectado por pares de bases coincidentes, algo así como dos secciones de una cremallera que se cierran juntas. Bueno, una sonda de ADN es una sección de ADN monocatenario que se asemeja a un lado de la cremallera. Esto significa que solo tiene un lado de los pares de bases y aún no coinciden. Puede estar pensando que LCR suena similar a la reacción en cadena de la polimerasa , que también es una técnica que amplifica la cantidad de ADN. La diferencia es que la reacción en cadena de la polimerasa amplifica un segmento de ADN, mientras que la reacción en cadena de la ligasa amplifica una sonda de ADN corta. LCR también utiliza dos enzimas, polimerasa y ligasa. La LCR es útil siempre que los científicos necesiten identificar mutaciones de un par de bases en cadenas de ADN. También es útil para encontrar cambios en el ADN de los virus y puede conducir al desarrollo de mejores vacunas contra las infecciones virales.

Proceso de reacción en cadena de la ligasa

Entonces, ¿cómo se lleva a cabo este proceso? Bueno, primero tienes que tener la sonda de ADN adecuada que se unirá a tu secuencia objetivo. Por ejemplo, si su secuencia objetivo es ATGC, necesitará una sonda de ADN con los pares de bases complementarios de TACG. La sonda de ADN asegurará que se amplifique la secuencia objetivo. El proceso LCR se lleva a cabo en tres pasos básicos en un termociclador.

1. Desnaturalización : el ADN se calienta para que la estructura bicatenaria se convierta en una sola. Los enlaces de hidrógeno se rompen, lo que permite que los pares de bases queden expuestos para que las sondas de ADN se puedan unir.
2. Recocido : dos conjuntos de sondas de ADN se unen a cada extremo de las hebras simples de ADN. Este paso marca dónde comenzará la duplicación del ADN. A partir de este punto, la polimerasa Taq , una enzima polimerasa de una bacteria amante del calor, agregará nucleótidos basados ​​en las hebras de ADN ya existentes.
3. Ligación : la ADN ligasa llenará el espacio en la hebra de ADN entre las sondas llenando el cebador apropiado. La ligasa solo reconocerá y ligará los cebadores que se hibridan correctamente con la sonda.

Después del paso de ligadura, el ADN se ha duplicado. Luego, estos pasos se repiten hasta que se crea la cantidad deseada de ADN. Cada vez que se completa el ciclo, la cantidad de ADN presente se duplica.

Detección e interpretación de resultados

Es posible pasar por todo este proceso y no obtener la molécula de ADN objetivo. Eso puede suceder si usa los cebadores, sondas, ligasas o polimerasas incorrectos. Por lo tanto, es importante saber lo que tiene para asegurarse de amplificar el ADN que desea. Para hacer esto, ejecute el producto LCR en una electroforesis en gel. Asegúrese de etiquetar el producto LCR con una sonda fluorescente o radioisótopo para que pueda detectarse. Utilice una escalera de ADN que le permita comparar el tamaño de su producto con el tamaño esperado. Si coinciden, enhorabuena, ¡tuvo éxito! Los termocicladores más nuevos le permiten determinar si su producto de ADN está ahí mediante cálculos. Esto se hace calculando la tasa de corte del analizador en el termociclador. El valor de corte se determina multiplicando la tasa media del analizador en el termociclador por 0,25. Luego, debe encontrar la relación entre su frecuencia de muestreo y la frecuencia de corte. Si su proporción está por encima de una tasa predeterminada para su muestra de ADN, entonces el ADN está ahí. Si está por debajo, entonces el ADN no está presente.

Resumen de la lección

La reacción en cadena de ligasa , o LCR para abreviar, es una técnica que amplifica la cantidad de sondas de ADN. Una sonda de ADN es una sección de una sola hebra de ADN. La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica de laboratorio que amplifica segmentos de ADN. Los tres pasos en LCR incluyen:

1. La desnaturalización -DNA se calienta de modo que la estructura bicatenaria se convierta en monocatenaria.
2. hibridación : las sondas de ADN se adhieren a cada una de las hebras individuales de ADN.
3. ligación : la ADN ligasa llenará el espacio en la hebra de ADN entre las sondas llenando el cebador apropiado. La detección del LCR se realiza mediante electroforesis en gel y producto LCR radiomarcado.

Para detectar el producto LCR, etiquételo para que se pueda ver.

Rodrigo Ricardo Editor y fundador