Rodrigo Ricardo

Dilución en serie en microbiología: cálculo, método y técnica

Publicado el 17 septiembre, 2020

Gran problema micro

Como saben, las bacterias están en todas partes, invisibles a simple vista, pero influyen en todos los entornos de la Tierra. ¿Qué sucede cuando necesita saber cuántas células bacterianas individuales están contaminando un alimento, viviendo en una muestra ambiental o creciendo en un tubo de cultivo? Necesita algún método para contar las bacterias con precisión. Pero no es raro que un cultivo líquido de bacterias tenga mil millones de células en cada mililitro de medio. Piense en eso por un segundo. En tu cocina, probablemente tengas una cucharadita. Cada cucharadita tiene alrededor de 5 mililitros. Eso significa que cada cucharadita de líquido podría contener 5 mil millones de bacterias. Incluso si contaras una bacteria por segundo, ¡te tomaría más de 150 años llegar a 5 mil millones! Evidentemente, esta no es una opción viable. ¿Entonces que puedes hacer? Necesita menos bacterias para contar. Idealmente, desea tener que contar solo entre 30 y 300 bacterias, un rango de números que solo toma como máximo unos minutos para contar. ¿Pero, cómo podemos llegar allí?

Dilución en serie

La respuesta es mediante dilución. Si simplemente extrae una cantidad exacta más pequeña de líquido de cultivo, puede contar esas bacterias y, en función de la cantidad que extrajo del total, puede determinar cuántas bacterias hay en su muestra original. Suena fácil, ¿verdad?

Pero primero, una analogía más: tiene miles de millones de células bacterianas y necesita bajar de 30 a 300. Para hacer eso, tendría que diluir su muestra alrededor de 10 millones de veces. Para hacer esto, necesitaría tomar aproximadamente 15 mililitros de su muestra, aproximadamente 3 cucharaditas, ¡y diluirlo en su piscina! Dudo que esta sea una opción viable, especialmente si está trabajando en un espacio de laboratorio reducido. En cambio, no diluyamos solo una vez. Podemos diluir una vez, luego diluir esta dilución, solo para diluir esta dilución, y así sucesivamente hasta llegar a la concentración adecuada de células. A esto se le llama dilución en serie.

Una dilución en serie es una serie de diluciones secuenciales que se utilizan para reducir un cultivo denso de células a una concentración más utilizable. Cada dilución reducirá la concentración de bacterias en una cantidad específica. Entonces, al calcular la dilución total de toda la serie, es posible saber con cuántas bacterias comenzó. La mejor manera de comprender completamente las diluciones en serie es probar el procedimiento usted mismo.

Cómo realizar una dilución en serie

Lo guiaré a través de un ejemplo de dilución en serie utilizando el método más fácil, pero, una vez que comprenda el concepto, puede cambiar los números reales a lo que funcione mejor para usted y hacerlo de la misma manera.

Para empezar, necesitamos 10 mililitros (10 ml) de su cultivo bacteriano original (etiquetado OBC). Antes de comenzar a diluir, necesitamos preparar varios espacios en blanco de dilución, que son tubos que contienen su líquido de dilución en cantidades exactas. Su líquido puede ser un medio de cultivo, solución salina, agua esterilizada o cualquier otro líquido apropiado. Para este ejemplo, necesitamos 5 espacios en blanco de dilución, numerados del 1 al 5. En cada tubo, necesitamos exactamente 9 ml de medio líquido. La razón por la que necesitamos 9 ml se hará evidente pronto.

Los tubos deben estar alineados así:


Cómo alinear los tubos para el ejemplo de dilución en serie
tubos alineados para dilución en serie

El primer paso es agitar o girar suavemente el tubo. Esto asegurará que sus células se distribuyan uniformemente en el tubo. Si sus células se depositan en el fondo y elimina el líquido sin agitar, corre el riesgo de no obtener suficientes células, invalidando su recuento final. Recuerde siempre girar el tubo antes de retirar el líquido.

Una vez agitado, transfiera con cuidado exactamente 1 ml de su tubo OBC al tubo 1. Ahora, debe tener 10 ml de líquido en el tubo 1. Exactamente una décima parte de sus células están ahora en un nuevo tubo con un volumen final de 10 ml. Acaba de realizar una dilución de 1 en 10, o podría escribirse 1/10. 1 es el volumen que transfirió y 10 es el volumen final del tubo después de la transferencia.

Ahora, ya ha terminado con el tubo OBC y el tubo 1 se convierte en el siguiente tubo que se diluye. Como hicimos antes, agite su tubo antes de transferir 1 ml del Tubo 1 al Tubo 2. Nuevamente, exactamente una décima parte de sus células en el Tubo 1 se transfieren al Tubo 2, con un volumen final de 10 ml. Al tubo 1 le deberían quedar exactamente 9 ml. El tubo 2 ahora contiene una dilución 1 en 10 del tubo 1. Para calcular la dilución total del tubo OBC, simplemente multiplique sus dos diluciones: 1/10 X 1/10 = 1/100. Hasta ahora, ha realizado una dilución 1/100 del cultivo bacteriano original.

Desea seguir el mismo procedimiento para los blancos de dilución restantes: 1 ml del tubo 2 se transfiere al tubo 3; 1 ml del tubo 3 se transfiere al tubo 4; y, finalmente, 1 ml del Tubo 4 se transfiere al Tubo 5. Cada transferencia es otra dilución 1 en 10. Para calcular la dilución final, simplemente multiplique todas las diluciones juntas: 1/10 X 1/10 X 1/10 X 1/10 X 1/10 = 1 / 100,000.

Ahora podríamos tener un número razonable de células para contar. Para terminar la técnica, imaginemos que contamos las celdas en el Tubo 5 y encontramos 50 celdas en total, justo en la zona deseada de 30 a 300. Para determinar con cuántas células comenzamos en nuestro cultivo original, todo lo que necesita hacer es multiplicar el recuento de células por la dilución total: 50 X 100,000 = 5,000,000 de células bacterianas en nuestra muestra original de 10 ml. ¡Apuesto a que preferirías contar hasta 50 que 5 millones!

Es importante tener en cuenta que puede utilizar cualquier volumen aquí. Si sus blancos de dilución son de 6 ml y está transfiriendo 1 ml, la dilución sería 1/7. Las matemáticas son exactamente las mismas: 1/7 X 1/7 X 1/7 X 1/7 = 1/2401. Tampoco es necesario tener el mismo volumen final en todos los tubos. Puede diluir 1/2, luego 1/5, luego 1/8. Simplemente multiplique como antes para obtener la dilución final: 1/2 X 1/5 X 1/8 = 1/80.

Ahora quizás se pregunte cómo contamos las células diminutas. Hay varios métodos que podrían usarse, pero usaremos el método de la placa de cultivo. Podemos tomar una muestra del Tubo 5 y hacer crecer las células en una placa de cultivo. Luego, una vez que las bacterias comienzan a crecer, forman colonias que eventualmente se vuelven lo suficientemente grandes como para verlas. Luego, podemos contar las colonias y volver a calcular para encontrar la concentración original de bacterias en nuestra muestra. ¡Felicidades! ¡Ha resuelto lo que comenzó siendo un problema bastante abrumador!

Resumen de la lección

Repasemos brevemente las diluciones en serie.

Una dilución en serie es una serie de diluciones secuenciales que se utilizan para reducir un cultivo denso de células a una concentración más utilizable. El método más sencillo es hacer una serie de diluciones 1 en 10. En este método, se transfiere exactamente 1 ml de cada dilución sucesiva a exactamente 9 ml de líquido en un blanco de dilución, creando una dilución 1/10. Para calcular la dilución final, todo lo que necesita hacer es multiplicar 1/10 X 1/10, continuando así para cada paso de la dilución. Para determinar exactamente con cuántas células comenzó, simplemente tome el número de colonias que contó y multiplíquelo por su factor de dilución final.

Los resultados del aprendizaje

Una vez que haya completado esta lección, es posible que pueda:

  • Cree una dilución en serie y reconozca su propósito
  • Identificar los pasos necesarios para desarrollar una dilución en serie.
  • Saber contar las células bacterianas

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