Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas: definición y aplicación
Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas
El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas es una herramienta útil utilizada por inmunólogos y otros científicos. También es un nombre largo y engorroso, por lo que lo llamamos ELISA para abreviar. Analicemos los componentes del nombre completo para tratar de averiguar qué es ELISA.
Ligado a enzima significa simplemente que se usa una enzima para ayudar a mostrar los resultados. Una enzima se une a un anticuerpo. Al final del ensayo, se agrega un sustrato . La enzima realizará una reacción química que dará como resultado un cambio de color. El cambio de color se puede visualizar directamente o, a veces, leer con la ayuda de una computadora.
Inmunoabsorbente significa que algo del sistema inmunológico está vinculado a otra cosa. En el caso de ELISA, un anticuerpo se une directa o indirectamente a la placa que se está utilizando.
Un ensayo es un término para una prueba cualitativa. Cuando junta todos los términos, ve que un ELISA es una prueba cualitativa que usa anticuerpos y enzimas para ver un cambio de color.
¿Qué es el protocolo básico de un ELISA?
Independientemente del tipo de ELISA que se realice, hay algunos pasos que son similares. Los ELISA se realizan en placas de 96 pocillos. Se trata de bandejas de plástico que tienen 12 filas y 8 columnas de pozos pequeños, donde se coloca la muestra. Los pocillos también son “pegajosos” para que la proteína (antígeno o anticuerpo) pueda unirse a ellos. Las placas de tamaño permiten que se procesen muchas muestras simultáneamente, por lo que las diferentes concentraciones se pueden comparar fácilmente.
El primer paso para la mayoría de los ELISA es recubrir la placa. Esto significa que se incuba durante la noche con un antígeno o anticuerpo en un tampón de recubrimiento especial. A continuación, se cubre el fondo del pozo con proteína. La placa se lava para eliminar el exceso de material después de este y todos los pasos posteriores.
El siguiente paso se llama bloqueo . La placa se incuba con una solución de proteína inespecífica. Esto ocupa todos los sitios de unión adicionales, para ayudar a evitar que el siguiente paso se adhiera al fondo de la placa.
Luego viene la detección , cuando se agrega al pocillo un anticuerpo ligado a una enzima. El anticuerpo solo debería unirse al material agregado en el primer paso ya que el resto del pocillo había sido bloqueado.
Finalmente, se agrega el sustrato y se usa para ver el resultado. Cuanto más oscuro era el pozo, más interacción había entre el anticuerpo ligado a la enzima y lo que se estaba midiendo.
Tipos de ELISA
Hay varias configuraciones de ELISA que se pueden utilizar. Cada uno tiene pros y contras.
ELISA directo
Un ELISA directo es muy simple y directo. El antígeno que se está estudiando se recubre en la placa. Luego, después del bloqueo, se agrega un anticuerpo ligado a una enzima a los pocillos. Finalmente se agrega el sustrato y se registran los resultados.
Los ELISA directos son más rápidos que otros métodos y, debido a que solo hay unos pocos pasos, hay menos posibilidades de error humano. Pueden ser más propensos a mostrar una unión no específica o tener un ruido de fondo más alto. También requieren un anticuerpo ligado a enzimas específico para cada antígeno que se está estudiando.
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ELISA sándwich
Un ELISA tipo sándwich es útil para analizar si un antígeno específico está en una solución. En este ensayo, el antígeno se intercala entre dos anticuerpos: un anticuerpo de captura y un anticuerpo de detección.
Primero, la placa se recubre con el anticuerpo de captura. Después del bloqueo, se agrega la solución que se está midiendo. Luego, se agrega el anticuerpo de detección, que está ligado a una enzima. Finalmente se añade el sustrato para que se pueda leer el ELISA.
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ELISA competitivo
Se utiliza un ELISA competitivo para determinar la concentración de antígeno en una solución. Primero, se incuba un antígeno específico con su anticuerpo. Este anticuerpo no está etiquetado y se denomina anticuerpo primario. Luego, la placa se recubre con el antígeno y se bloquea normalmente. El anticuerpo primario, unido al antígeno, se agrega a los pocillos. Finalmente, se agrega un anticuerpo secundario, ligado a una enzima, para ayudar
Los anticuerpos que ya están unidos al antígeno no permanecerán adheridos a la placa. Sin embargo, los anticuerpos libres pueden hacerlo. Entonces, si hay una concentración baja de antígeno en la solución, habrá más anticuerpos libres. Estos anticuerpos libres pueden unirse al antígeno que recubre la placa. El resto desaparecerá.
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Resumen de la lección
Los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) son una herramienta importante para estudiar la inmunidad, la microbiología y las proteínas. Utilizan reacciones enzimáticas para crear un cambio de color que el investigador puede ver.
Todos los ELISA requieren algunos pasos importantes.
- Recubra la placa con antígeno o anticuerpo
- Bloquear la placa para evitar una unión inespecífica
- Detectar con un anticuerpo ligado a enzimas
- Leer la placa después de agregar un sustrato que cambia de color
Hay varios tipos de ELISA que se pueden realizar. Un ELISA directo tiene el antígeno cubierto en la placa. El antígeno se detecta con un anticuerpo ligado a una enzima.
Los ELISA tipo sándwich tienen la placa recubierta con un anticuerpo de captura. Luego, se agrega una solución que contiene el antígeno. Por último, se agrega un anticuerpo de detección.
Los ELISA competitivos utilizan dos anticuerpos, uno primario y otro secundario. El anticuerpo primario se incuba con una solución con antígeno. El mismo antígeno se utiliza para recubrir la placa. Luego, se agrega la solución primaria de anticuerpo-antígeno. Los anticuerpos libres se unirán al antígeno de la placa, mientras que el resto se eliminará por lavado. El anticuerpo secundario se utiliza para la detección.
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