PCR: Pasos involucrados en la reacción en cadena de la polimerasa

Revisión de reactivos de PCR

Periodista: Profesor Pear, gracias por tomarse el tiempo de explicar la evidencia forense en el caso que exoneró al Coronel Custard e implicó al Sr. Teal en la escalera de caracol con la tubería de plomo que mató al Sr. Bones.

Profesor Pear: Oh, es un placer. ¿No es sorprendente cómo un científico forense puede usar la PCR para tomar una pequeña cantidad de ADN de la escena del crimen y hacer suficientes copias para su análisis? PCR significa reacción en cadena de la polimerasa y es un procedimiento de laboratorio que se puede utilizar para crear copias de ADN. Hay cinco reactivos básicos, o ingredientes, necesarios para la PCR: molde de ADN, cebadores de PCR, nucleótidos, polimerasa Taq y tampón de PCR.

Periodista: Sí, sí. Gracias por la revisión, profesor, pero ya me explicó qué reactivos son necesarios para la PCR. Ahora, ¿podría explicar cómo se utilizan los reactivos para producir más ADN?

Profesor Pear: Lo siento. Estos reactivos se mezclan en un tubo de PCR y se colocan en una máquina de PCR. Pronto se hará evidente por qué una máquina es realmente importante, pero permítanme explicar primero los pasos en PCR.

Paso de desnaturalización

Profesor Pear: Recuerde que la PCR es como una replicación artificial en un tubo. En la replicación del ADN, la enzima helicasa rompió los enlaces de hidrógeno entre pares de bases complementarios .

Periodista: Pero no estamos agregando helicasa al tubo de PCR, ¡así que no va a funcionar!

Profesor Pear: Bueno, sí y no. Es cierto que no estamos agregando helicasa, pero hay una muy buena razón. Si bien son realmente geniales, las enzimas son un poco caras y, a veces, es complicado trabajar con ellas. Los científicos idearon una forma más simple y mucho menos costosa de romper los enlaces de hidrógeno: simplemente calentar la solución. Al elevar la temperatura de la solución de PCR justo por debajo de la ebullición, se rompen todos los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las hebras complementarias de ADN. Esto se conoce como el paso de desnaturalización en PCR.

Periodista: Oh, ahora veo por qué no se puede usar la polimerasa humana. Este paso mataría la proteína porque una proteína humana no está diseñada para funcionar a esta temperatura. Pero la polimerasa Taq funciona en la PCR porque proviene de una bacteria que normalmente vive en aguas termales .

Profesor Pear: Eso es exactamente correcto.

Paso de recocido

Profesor Pear: Si volvemos a utilizar la replicación del ADN como guía, el siguiente paso que debe ocurrir es que los cebadores deben unirse a la plantilla de ADN. En la replicación, una enzima, la ARN primasa, crea el cebador nucleótido por nucleótido en la plantilla de ADN.

En la PCR, muchas moléculas de cebadores de ADN artificiales ya están en el tubo de PCR. Durante el segundo paso de la PCR, llamado paso de hibridación , los cebadores se unen o se hibridan con la plantilla de ADN. La PCR requiere dos cebadores diferentes, uno que pueda unirse a cada hebra de la molécula de ADN.

Paso de extensión / alargamiento

Profesor Pear: Recuerde que la PCR solo amplificará una determinada región de ADN, no toda la plantilla de ADN. Los cebadores representan el punto de partida para el siguiente paso, llamado paso de extensión . Durante el paso de extensión, o alargamiento, la polimerasa Taq se une a cada cebador de PCR y comienza a agregar nucleótidos. Tenga en cuenta que Taq, como la ADN polimerasa humana, solo puede agregar nucleótidos de ADN en una dirección.

Esta es la razón por la que necesita dos cebadores que se encuentran a cada lado de la región que desea amplificar. Cada cebador está orientado a amplificar una de las cadenas complementarias. El paso de extensión se llama así porque el producto de la PCR continúa extendiéndose durante este paso.

Reportero: ¡Espera! No lo entiendo. Mira los productos de PCR. Pensé que dijiste que este era un proceso preciso, pero eso no parece muy específico o preciso en absoluto. Parece que se copiaron más que solo las secuencias de destino.

Ciclos de PCR

Profesor Pear: Buen punto. El problema es que aún no hemos terminado con el proceso de PCR. La PCR se realiza típicamente en ciclos. Es decir, he mencionado tres pasos separados que pueden producir dos copias de nuestro ADN objetivo a partir de una sola copia. Para hacer millones de copias, debemos realizar estos tres pasos varias veces. El proceso de repetir los pasos de desnaturalización, hibridación y extensión de la PCR se conoce como ciclo de PCR .

Si bien el tampón de PCR asegura que la concentración de sal y el nivel de pH óptimos se mantengan durante todo el proceso de PCR, los científicos han determinado que cada paso es óptimo a una temperatura diferente. Entonces, un procedimiento de ciclismo típico podría verse así:

Sin embargo, estos tres pasos constituyen un ciclo único que se repite entre 25 y 30 veces. Ahora puede ver por qué es útil utilizar una máquina de PCR o un termociclador. Puede programar la máquina para cambiar la temperatura de los tubos de PCR automáticamente en lugar de transferir los tubos de PCR manualmente a baños de agua con diferentes temperaturas.

Amplificación de plantilla

Profesor Pear: Como verá, el ciclo no solo crea un nuevo producto de PCR, sino que también proporciona la especificidad. Ya consideramos lo que sucede después de una ronda de amplificación; veamos qué sucede en las próximas rondas.

Recuerde que todo sigue en el mismo tubo, por lo que los productos de la primera ronda de PCR se convierten en la nueva plantilla de ADN para la segunda ronda. Eso significa que tenemos las dos cadenas de ADN originales nuevamente como plantillas, pero también tenemos estas dos nuevas cadenas que son un poco más cortas. Desnaturalicemos, templemos y extendamos una segunda vez, y veamos qué obtenemos esta vez. Observe que la longitud de los productos de PCR ha cambiado algo.

Veamos qué pasa después del tercer ciclo de PCR. Ahora, hemos producido un producto específico para la región entre nuestros cebadores de PCR. A medida que avanzan los ciclos de PCR, estos productos de PCR específicos comienzan a representar una proporción cada vez mayor de la población de ADN. Con el tiempo, las piezas de ADN no específicas se vuelven estadísticamente insignificantes en comparación con la secuencia de PCR objetivo.

Resumen de la lección

Periodista: ¡ Eso es fascinante! Aunque eso fue mucho para digerir; déjame ver si entendí todo lo que dijiste. PCR significa reacción en cadena de la polimerasa y es un procedimiento de laboratorio que se puede utilizar para crear copias de ADN.

El primer paso en un ciclo de PCR es el paso de desnaturalización . Este es el paso de la PCR en el que se rompen los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las hebras complementarias de ADN.

El segundo paso en un ciclo de PCR es el paso de recocido . El paso de hibridación es el paso de PCR en el que los cebadores se hibridan o se unen a la plantilla de ADN.

El tercer paso en un ciclo de PCR es el paso de extensión . El paso de extensión, también conocido como paso de elongación, es el paso de PCR en el que la polimerasa Taq agrega nucleótidos al cebador apareado.

El proceso de repetir los pasos de desnaturalización, hibridación y extensión de la PCR se conoce como ciclo de PCR . La naturaleza cíclica de la PCR permite que el procedimiento produzca específicamente millones de copias del ADN diana.

Resultado de aprendizaje

Después de esta lección, tendrá la capacidad de:

• Describir lo que sucede durante cada paso del ciclo de PCR.
• Explicar el propósito de la naturaleza cíclica de la PCR.

Rodrigo Ricardo Editor y fundador