Propósito de la electroforesis en gel
La electroforesis en gel es un procedimiento de laboratorio que se utiliza para separar moléculas biológicas con una corriente eléctrica. Anteriormente, hemos hablado de la electroforesis en gel en el contexto del análisis de ADN . Usando una corriente eléctrica y una molécula que se comporta como gelatina, llamada agarosa, podemos separar moléculas de ADN según el tamaño. Aunque la electroforesis en gel de agarosa puede usarse para una variedad de propósitos, dos de los usos más comunes con respecto al ADN son verificar el éxito de una digestión de restricción o una etapa de ligación en un experimento.
Analizar un resumen de restricciones
La electroforesis en gel de agarosa es un medio eficaz para determinar si un procedimiento de digestión por restricción ha tenido éxito. Consideremos un ejemplo simple de cómo funciona esto. A menudo, los científicos quieren expresar una proteína en una célula o tejido donde normalmente no se encuentra. Supongamos que queremos hacer maíz resistente a las plagas, para no tener que usar tantos pesticidas químicos. Para hacer esto, combinemos el ADN de dos genes diferentes, para que se pueda expresar una toxina de plaga en nuestro cultivo. Podríamos lograr esto cortando cada gen con la misma enzima de restricción y combinando los fragmentos de ADN para crear un nuevo gen recombinante. Pero, antes de que se pueda crear cualquier ADN recombinante, nos gustaría verificar que el resumen de restricción se haya completado con éxito.
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Digamos que el gen 1 es un gen del maíz que tiene 4 kilobases de largo, pero solo queremos usar los primeros 0.5 kilobase en nuestro nuevo gen recombinante. Y el gen 2 es un gen de resistencia a las plagas que tiene 3 kilobases de largo, pero solo queremos usar los últimos 2.5 kb en el gen recombinante. En ambos casos, el resumen de restricción debe reemplazar la banda en el carril sin cortar con dos bandas más pequeñas en el carril digerido.
Usando un patrón de escalera de ADN
Además de concluir que una pieza de ADN se ha cortado en dos fragmentos de ADN más pequeños, también podemos determinar el tamaño tanto de la muestra de ADN inicial como del producto de una digestión de restricción. Recuerde que podemos usar un conjunto de moléculas de ADN de longitud conocida, llamado escalera de ADN , para determinar el tamaño de los fragmentos de ADN en un gel de electroforesis. Una escalera de ADN nos permite sacar conclusiones más precisas sobre los resultados de nuestra electroforesis en gel. Observe la escalera de ADN en el carril uno del siguiente ejemplo. Como conocemos el tamaño de cada una de estas bandas, podemos utilizarlas como punto de referencia para las muestras experimentales. Considere el carril dos del gel. Al comparar la banda en el carril dos con los estándares de ADN de tamaño conocido, podemos concluir que nuestra muestra de ADN inicial era de hecho del tamaño correcto. Además, también podemos concluir que la muestra no contenía ningún contaminante de ácido nucleico detectable que pudiera interrumpir los pasos experimentales futuros. A continuación, considere el carril tres del gel. Las bandas del carril tres representan el ADN del gen del maíz que ha sido digerido con una enzima de restricción. En lugar de simplemente concluir que se cortó el ADN inicial, utilizando los estándares de la escalera de ADN como punto de comparación, podemos determinar si el ADN se cortó en la ubicación correcta.
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Tenga en cuenta que la banda de 4 kb en el carril dos se ha convertido en dos bandas de 3,5 kb y 0,5 kb en el carril tres. Por lo tanto, podemos concluir que la digestión de restricción produjo fragmentos de ADN del tamaño esperado. Además, es importante señalar que también podemos concluir que todo el ADN inicial se cortó porque la banda de 4 kb ya no está presente en el carril tres.
Una herramienta de resolución de problemas
Hemos discutido cómo se puede usar la electroforesis en gel para verificar que los experimentos hayan funcionado correctamente. Otra función importante de la electroforesis en gel es ayudar a identificar la causa de un problema cuando algo sale mal. Ahora, considere los carriles cuatro y cinco de nuestro gel de muestra. Estos carriles representan la digestión de restricción realizada sobre el gen de resistencia a las plagas. ¿Qué bandas de tamaño predecimos ver en cada carril? Recuerde que nuestro ADN inicial es de tres kilobases esta vez. Y, la enzima de restricción que usamos debería producir un fragmento de 2,5 kb y 0,5 kb. Sorprendentemente, a diferencia de nuestro resumen anterior, el carril cinco posee tres bandas en lugar de dos. Además de las bandas de 2,5 kb y 0,5 kb que predecimos que producirá la digestión de restricción, también vemos una banda tenue a los 3 kb. ¿Qué significa esto? Esta banda de 3 kb probablemente representa ADN sin cortar. La electroforesis en gel de agarosa nos ha alertado de que la digestión estaba incompleta y que los pasos experimentales futuros pueden verse comprometidos si no rehacemos esta etapa de digestión. Debido a que el ADN inicial produjo una banda de 3 kb del tamaño esperado, podemos concluir que nuestra muestra de ADN inicial parece estar bien. Además, basándonos en los resultados, podemos concentrarnos en determinar si algo andaba mal con la enzima de restricción o si la digestión se configuró incorrectamente. Por lo tanto, la electroforesis en gel ha identificado el problema y ha reducido la investigación de resolución de problemas.
Analizar una reacción de ligadura
Otra razón principal para utilizar la electroforesis en gel es el análisis de una reacción de ligadura. Si se han cortado dos piezas de ADN con la misma enzima de restricción, tendrán extremos pegajosos complementarios. Pueden formarse enlaces de hidrógeno entre extremos pegajosos complementarios, y la enzima ligasa se puede utilizar para unir las moléculas de forma permanente formando un enlace entre fosfatos y azúcares adyacentes en las dos moléculas de ADN.
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Pero, ¿cómo determinaremos si las piezas del maíz y los genes de resistencia a las plagas se han ligado con éxito? Al comparar las muestras de ADN de partida y los productos de ligadura en un gel de electroforesis de agarosa, también podemos determinar la efectividad de este paso. Nuevamente, la escalera de ADN se encuentra en el carril uno de este gel. Observe que un experimento de ligación exitoso da como resultado la formación de un fragmento de 3 kb, que representa el nuevo gen recombinante.
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Resumen de la lección
En resumen, la electroforesis en gel es un procedimiento de laboratorio que se utiliza para separar moléculas biológicas con una corriente eléctrica. Dos usos principales de la electroforesis en gel son el análisis de los resultados experimentales de ligadura y digestión por restricción. Una escalera de ADN es una solución compuesta por moléculas de ADN de longitud conocida que se utiliza para determinar el tamaño de los fragmentos de ADN en muestras experimentales. Se puede utilizar para verificar el tamaño de los fragmentos de ADN antes o después de un protocolo experimental, como una digestión de restricción o ligación de ADN.
Resultado de aprendizaje
Al final de este video, podrá analizar los resultados de los experimentos de digestión por restricción y ligadura mediante electroforesis en gel.
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