El método Sanger de secuenciación de ADN

Método de secuenciación de Sanger

Periodista: Profesor Pear, creo que nuestros lectores disfrutarán aprendiendo cómo los científicos forenses pueden usar el ADN para distinguir entre sospechosos, como lo hizo usted en el caso del Asesino de la escalera en espiral. Profesor Pear: En realidad, hay varias formas en que un científico puede usar el ADN para identificar a una persona. El análisis de la secuencia de ADN se ha vuelto cada vez más sofisticado con el tiempo. Periodista: Um, ¿por qué no me cuenta un método básico para distinguir entre dos personas? Profesor Pear: Bueno, supongo que puedo contarles sobre el método que Fredrick Sanger desarrolló para la secuenciación del ADN. El método Sanger permite a los científicos determinar la secuencia de ADN de una muestra. Ahora existen formas más sofisticadas de analizar muestras forenses, pero comprender cómo funciona la secuenciación básica será un buen punto de partida para sus lectores.

Estructura de didesoxinucleótidos

Profesor Pear: La secuenciación de Sanger es realmente bastante ingeniosa. Es un procedimiento de laboratorio que determina la secuencia del ADN mediante el uso de didesoxinucleótidos. Es por eso que a veces también se lo denomina secuenciación didesoxi . Periodista: Uh, profesor, ¿qué es un didesoxinucleótido? Profesor Pear: Vaya. Tonto de mí. Un didesoxinucleótido es un nucleótido al que le falta el grupo 3′-hidroxilo de su azúcar. Es básicamente un tipo especial de nucleótido que los científicos usan en el método de secuenciación de Sanger. Repasemos los didesoxinucleótidos después de contarles un poco sobre el procedimiento de secuenciación.

Los didesoxinucleótidos son terminadores de cadena

Profesor Pear: Pero antes de discutir el procedimiento de secuenciación, consideremos un ejemplo simple. Imagina que tú y yo estamos jugando a un juego de palabras. El objetivo del juego es que adivines la frase que he escrito en base a una serie de pistas que te proporciono. Te diré una carta y la ubicación de esa letra en la oración. Por ejemplo, si te digo que la tercera letra de la izquierda de la oración es e , la primera letra de la izquierda es t y la segunda letra de la izquierda es h , podrías decirme que las primeras tres letras de esta oración son los . Tenga en cuenta que no importa en qué orden le dé cada pista, siempre que cada pista le proporcione una letra y una posición dentro de la oración. Si proporciono una pista para cada carácter de la oración, puedes armar una oración completa, ¿verdad? Periodista: Eso tiene sentido, pero ¿qué tiene que ver con la secuenciación del ADN? Profesor Pear: Así es conceptualmente cómo funciona la secuenciación de Sanger. Necesitamos dos datos para aplicar la estrategia de nuestro juego de oraciones a la secuenciación del ADN.

El primer paso para aplicar el método Sanger es identificar el tipo de nucleótido en una secuencia de ADN.

Primero, necesitamos conocer la identidad del nucleótido. ¿Es una G, A, T o C? En segundo lugar, necesitamos saber la ubicación del nucleótido. Por ejemplo, ¿es el primer, sexto o décimo nucleótido de la secuencia? Los didesoxinucleótidos son la respuesta a ambas preguntas. Recuerde la estructura del ADN. Los nucleótidos de una molécula de ADN se mantienen unidos mediante enlaces fosfodiéster. Estos enlaces fosfodiéster pueden formarse porque el fosfato en el extremo 5 ‘de un nuevo nucleótido puede reaccionar con el grupo hidroxilo, o -OH, en el extremo 3′ de la molécula de ADN en crecimiento. Un didesoxinucleótido carece de este grupo 3’-hidroxilo. Eso significa que la polimerasa no puede agregar otro nucleótido una vez que se ha agregado un didesoxinucleótido a una cadena de nucleótidos.

Secuenciación de ADN de terminación de cadena

Profesor Pear: Los científicos pueden usar una mezcla de nucleótidos regulares (abreviado dNTP) y didesoxinucleótidos (ddNTP) para secuenciar el ADN. Comencemos con una mezcla de algunos ddGTP, pero principalmente los cuatro dNTP regulares: ADN de plantilla, tampón, un cebador de ADN y ADN polimerasa. Periodista: Espere. Esos ingredientes suenan familiares. ¿No son esos básicamente los mismos ingredientes que usa en PCR? Profesor Pear: ¡Sí! Este procedimiento de secuenciación de ADN es similar a la PCR , el procedimiento de laboratorio que se utiliza para crear copias de ADN. Sin embargo, en lugar de un par de cebadores de ADN como la PCR, la secuenciación de Sanger usa solo un cebador. Verá, la cartilla proporciona un punto de referencia inicial. En nuestro juego de palabras, tenga en cuenta que si no sabía qué lado de la oración estaba usando su pista como punto de referencia, rápidamente se convierte en un juego muy difícil. Por lo tanto, el uso de un solo cebador proporciona un punto de referencia claro para nuestros datos de secuencia. La mayoría de las veces, la ADN polimerasa agrega dNTP al cebador a medida que forma una nueva molécula de ADN. Sin embargo, siempre que se agregue uno de los ddGTP más raros, no se pueden agregar más nucleótidos debido a la estructura de los didesoxinucleótidos. En este punto, sabemos que el último nucleótido de esta secuencia es una G porque solo agregamos ddGTP a este tubo.

Cuando se introduce un didesoxinucleótido (ddNTP) en una secuencia de ADN, no se agregan más nucleótidos.

Muchas, muchas de estas reacciones tienen lugar simultáneamente en el tubo, pero el punto en el que se incorpora un ddGTP es completamente aleatorio en cada caso. Por lo tanto, todas estas reacciones producirán moléculas de ADN de diferente longitud que terminan en un ddGTP. Reportero: Está bien. Creo que entiendo cómo producir esos fragmentos, pero parece que me llevaría una eternidad ordenar todos esos datos. Profesor Pear: Oh, buen punto. Todos esos datos probablemente parecen un poco abrumadores. Pero recuerde que la electroforesis en gel es una buena forma de distinguir entre moléculas de ADN de diferentes tamaños. Veamos qué tipo de resultados obtendríamos si realizáramos cuatro reacciones diferentes con cada uno de los posibles ddNTP y luego analizáramos esos datos en un gel.

Interpretación de datos de secuenciación de Sanger

Profesor Pear: Aquí hay un ejemplo de esos datos en un gel de secuenciación.

Datos en un gel de secuenciación

Puede parecer una sobrecarga de información, pero vayamos paso a paso. Recuerde que los fragmentos de ADN más cortos viajan más lejos en un período de tiempo determinado que los fragmentos de ADN más largos durante la electroforesis en gel. Por lo tanto, si comenzamos en la parte inferior de nuestro gel y ‘leemos’ hacia arriba, podemos ‘leer’ nuestra secuencia de ADN con el cebador de secuenciación como punto de referencia inicial. La banda situado más bajo en el gel es una A . La banda inmediatamente inferior es una camiseta . La tercera banda es una G , y así sucesivamente. De esta forma, podemos determinar fácilmente la secuencia del segmento de ADN que estábamos analizando. Periodista: Vaya. Ese análisis fue mucho menos complicado de lo que pensé. Profesor Pear: Como mencioné antes, esta es una versión muy simple de analizar el ADN. Hoy en día, el análisis forense utiliza técnicas y tecnologías más sofisticadas que son más rápidas y sensibles que este ejemplo básico. Sin embargo, es de esperar que este ejemplo le ayude a comprender los principios básicos de cómo los científicos pueden determinar la secuencia de ADN de un individuo. Y, con suerte, esta explicación le ha dado una idea de lo poderosa que puede ser la evidencia forense para un caso criminal como este. Al probar catorce ubicaciones diferentes en el genoma humano, estábamos seguros de que el ADN del Sr. Teal, y no el del Coronel Custard, se había encontrado en la escena del crimen. Esto ayudó a que el caso contra el coronel Custard se retirara y llevó al fiscal de distrito a considerar acusar al Sr. Teal de matar al Sr. Bones en la escalera de caracol con la tubería de plomo.

Resumen de la lección

Periodista: Profesor, gracias por su explicación. Eso fue muy esclarecedor. Permítanme verificar que mis notas sean correctas. La secuenciación de Sanger es un procedimiento de laboratorio que determina la secuencia de ADN mediante el uso de didesoxinucleótidos como terminadores de secuencia. Un didesoxinucleótido es un nucleótido al que le falta el grupo 3′-hidroxilo de su azúcar. Se utiliza en la secuenciación de Sanger como terminador de cadena. Cuando se incorpora un didesoxinucleótido en la cadena de ADN en crecimiento, evita que se agreguen más nucleótidos. Al realizar esta reacción con cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos diferentes, se producen productos de ADN de diferentes longitudes. Estos productos de secuenciación se pueden ordenar por tamaño utilizando electroforesis en gel. Y, utilizando el cebador como punto de partida, la secuencia de ADN se lee desde la parte inferior del gel hacia arriba.

Resultado de aprendizaje

Podrás explicar la importancia de la secuenciación del ADN y cómo funciona el método Sanger después de ver este video.

Rodrigo Ricardo Editor y fundador