¿Qué es la electroforesis en gel de agarosa?

Revisión de la ingeniería genética

Hasta ahora, hemos aprendido que la ingeniería genética implica cambiar la composición genética de un organismo. Hemos estado explorando los entresijos de la ingeniería genética imaginándonos en la piel de los científicos que diseñaron la producción de insulina humana en bacterias.

Repasemos lo que hemos hecho hasta este momento para lograr este objetivo. Primero, escindimos el gen de la insulina humana del genoma humano utilizando enzimas de restricción. Después de extirpar el gen de la insulina, usamos ADN ligasa para pegar el gen en un plásmido. El plásmido servirá como vector para transportar el gen a una célula bacteriana huésped. Pero ahora nos estamos adelantando.

Está muy bien decir que estamos usando enzimas de restricción y ADN ligasa en nuestros experimentos, pero ¿cómo sabemos si han hecho su trabajo o no? Quiero decir, ¿cómo sabemos si el ADN se cortó en el primer paso o si el gen y el plásmido se ligaron en el segundo paso? ¿No sería terrible llegar hasta el final de nuestro proyecto y luego descubrir que cometimos un error en el primer o segundo paso? ¿Hay algo que podamos hacer? La respuesta es la electroforesis en gel .

Mecanismo de electroforesis

La electroforesis en gel es un procedimiento de laboratorio que utiliza una corriente eléctrica para separar moléculas biológicas, generalmente ácidos nucleicos o proteínas, según el tamaño.

Puede recordar el modo de acción de la electroforesis basado en las raíces de la palabra. No es sorprendente que electro- se refiera a la electricidad, y -foresis se deriva de una palabra griega que significa «llevar». Entonces, el nombre, esencialmente, significa ‘transportado por electricidad’.

¿Cómo nos va a ayudar la electricidad? Recuerde la estructura del ADN. Un solo nucleótido de ADN está compuesto por un azúcar, un fosfato y una base nitrogenada. Además, recuerde que una partícula cargada se moverá cuando se coloque en un campo eléctrico. Por lo tanto, si una molécula de ADN posee una carga, se moverá si le aplicamos una corriente eléctrica.

La pregunta es si tiene carga y, de ser así, si la carga es positiva o negativa. Recuerde que los átomos de fósforo y oxígeno forman el grupo fosfato de un nucleótido de ADN. Ambos elementos están ubicados en el lado derecho de la tabla periódica y, como tales, son átomos electronegativos que atraen fuertemente a los electrones. Esto le da al grupo fosfato en un nucleótido de ADN una carga negativa neta. Por lo tanto, las moléculas de ADN tienen carga negativa.

¿Cómo se comportará una carga negativa en un campo eléctrico? Bueno, un circuito eléctrico consta de dos electrodos: uno positivo y otro negativo. Las partículas cargadas negativamente son atraídas por cargas positivas y repelidas por cargas negativas. Por lo tanto, las moléculas de ADN se moverán hacia el electrodo positivo del circuito durante la electroforesis en gel.

Agarosa

La agarosa se convierte en un gel para separar las moléculas de ADN por tamaño.

¡Fantástico! Ahora tenemos un medio para mover fragmentos de ADN. Pero no tenemos un medio para distinguir entre diferentes tamaños de fragmentos. Podemos mover los fragmentos de ADN, pero aún no podemos distinguir entre los grandes y los pequeños. Afortunadamente, los científicos descubrieron que podían aislar una molécula de las algas, llamada agarosa . La agarosa es un polisacárido que se puede usar para formar un gel para separar moléculas según el tamaño.

Básicamente, la agarosa se comporta como la gelatina. Los científicos pueden calentar y enfriar una mezcla de agarosa para formar un gel. Esto les permite darle una forma útil a la solución de agarosa una vez que se enfría. La agarosa se forma típicamente en un ladrillo delgado y plano con agujeros rectangulares en un extremo. Estos orificios, llamados pozos, proporcionarán un lugar para colocar las muestras de ADN al comienzo del procedimiento de electroforesis.

Cómo la agarosa separa los fragmentos de ADN

Entonces, una vez que la solución de agarosa se enfría, se convierte en un gel de moléculas de agarosa entrelazadas. Este gel consta de poros microscópicos a través de los cuales puede moverse el ADN. La velocidad a la que los fragmentos de ADN pueden deslizarse a través de los poros de este gel se basa en el tamaño.

Pensemos en esta idea de otra manera. Imagina que tengo un colador con agujeros del tamaño de fideos espaguetis. Tengo espaguetis de todos los tamaños, pero me gustaría separar los fideos de diferentes tamaños. Si comparo la velocidad a la que un fideo de una pulgada de largo y un fideo de un pie de largo se mueven a través del colador, ¿qué esperas ver? El fideo más corto debería salir a chorros por un agujero más rápido que el fideo más largo, ¿verdad?

Este mismo principio rige la electroforesis en gel de agarosa. Los pequeños fragmentos de ADN se mueven a través de los poros del gel de agarosa más rápido que los fragmentos más largos. Fragmentos del mismo tamaño maniobran a través del gel a la misma velocidad. De esta forma, se producen bandas de ADN que representan fragmentos de ADN de diferentes tamaños.

¿Por qué el ADN aparece como una banda en lugar de decir una forma circular o triangular? El ADN simplemente se movió directamente a través del gel desde los pocillos iniciales. Esto produce una banda del mismo ancho que los pozos iniciales.

Electroforesis en gel como punto de control

La electroforesis en gel de agarosa comprueba la eficacia de los pasos de ligadura y digestión de restricción.

¿Cómo se puede utilizar la electroforesis en gel para comprobar la eficacia de los pasos de ligadura y digestión de restricción de nuestro experimento de ingeniería genética? La electroforesis en gel de agarosa se puede utilizar para comparar la muestra inicial y el producto de cada paso.

Por ejemplo, compare el ADN sin cortar en el primer carril con el ADN cortado en el segundo carril. Tenga en cuenta que el fragmento más grande encontrado en el primer carril ha sido reemplazado por dos fragmentos más pequeños en el segundo carril.

A continuación, considere el ADN no ligado en el primer y segundo carriles con el producto ligado en el tercer carril. Tenga en cuenta que podemos decir que el paso de ligadura fue exitoso porque los fragmentos iniciales más pequeños han sido reemplazados por un solo fragmento más grande en la línea del producto.

El uso de electroforesis en gel de agarosa para comprobar el éxito de los pasos de digestión por restricción y ligadura es un elemento básico en los experimentos de laboratorio. Sin embargo, es importante señalar que estamos considerando una explicación muy simplificada de la ingeniería genética en esta lección. En un genoma del tamaño de un humano, cualquier enzima de restricción cortaría en sitios además de los adyacentes al gen de interés. Esto haría necesarios otros experimentos para identificar el fragmento correcto, o el gen podría eliminarse de una manera más específica.

Resumen de la lección

En resumen, la electroforesis en gel es un procedimiento de laboratorio que se utiliza para separar moléculas biológicas con una corriente eléctrica. Debido a la carga negativa del grupo fosfato de los nucleótidos del ADN, las moléculas de ADN se moverán hacia el electrodo positivo del circuito durante la electroforesis en gel. Entre otras cosas, los científicos suelen utilizar este procedimiento para distinguir entre moléculas de ADN de diferentes tamaños.

La agarosa es un polisacárido que se puede usar para formar un gel para separar moléculas según el tamaño. La velocidad a la que los fragmentos de ADN pueden deslizarse a través de los poros de este gel se basa en el tamaño. Los pequeños fragmentos de ADN se mueven a través de los poros del gel de agarosa más rápido que los fragmentos más largos.

Los resultados del aprendizaje

Al final de este video, podrá:

• Explicar el proceso y la importancia de la electroforesis en gel.
• Describir la estructura y función de la agarosa en electroforesis en gel.

Rodrigo Ricardo Editor y fundador