Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): optimización y protocolo
¿Cómo se optimiza una reacción en cadena de la polimerasa?
¿Te has preguntado alguna vez cómo estudian los científicos la función de los genes? El uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las primeras técnicas utilizadas para estudiar la función de un gen específico. Los científicos diseñan cebadores de oligonucleótidos para apuntar a una secuencia de ADN específica en un modelo animal. Un investigador amplificará y aislará una secuencia diana específica del gen de interés.
Para obtener mejores resultados, esta reacción debe optimizarse. La optimización comienza antes de que se configure la reacción. Los cebadores diseñados tienen una temperatura de fusión específica en función de la secuencia. Si un investigador desea resultados más estrictos, la temperatura de recocido durante la reacción estará más cerca de la temperatura de fusión, mientras que los resultados más promiscuos requerirán que la temperatura de recocido sea unos pocos grados más baja que la temperatura de fusión. Una regla general es usar una temperatura de recocido que sea 3-5 grados Celsius más baja que la temperatura de fusión.
Una segunda forma de optimizar una PCR incluye tener el tiempo de extensión adecuado . Los científicos suelen extender 1000 pares de bases de ADN por minuto. Esto significa que si un investigador quiere amplificar o aislar una secuencia de 3.489 pares de bases, el tiempo de extensión sería de 3,5 minutos.
Los científicos pueden usar kits especiales o polimerasas específicas para una PCR, cada uno con su propio protocolo. Es importante que cualquiera que realice una PCR por primera vez que utilice nuevos kits lea el protocolo proporcionado, ya que contiene la cantidad requerida de ADN, concentración de cebador y otros reactivos en la reacción.
Afortunadamente para los científicos, años de estudio de esta reacción han proporcionado temperaturas y tiempos optimizados para cada etapa de una PCR. Cuando se utilizan polimerasas como vent y taq , la temperatura de extensión óptima es de 72 grados Celsius. La temperatura de desnaturalización del ADN es de 95 grados Celsius y suele ser suficiente un tiempo de incubación de 2 a 5 minutos a esta temperatura.
Ahora que hemos cubierto cómo optimizar una PCR, ahora repasaremos un protocolo estándar.
¿Cuál es el protocolo de un PCR?
Aunque se requiere optimización para cada PCR, el protocolo general para una PCR permanece constante. Cada PCR consta de 5 etapas, y las 3 etapas intermedias se repiten unas 30 veces en un ciclo.
- Desnaturalización inicial: la temperatura de desnaturalización inicial se establece en 95 grados Celsius, ya que es la temperatura donde se rompen los enlaces de hidrógeno del ADN. Esta etapa dura entre 2 y 10 minutos.
- Desnaturalización: el primer paso del ciclo repetitivo de una PCR. La temperatura se fija en 95 grados centígrados. Este tiempo de desnaturalización es más corto que el tiempo de desnaturalización inicial, ya que generalmente es de solo 15-30 segundos.
- Recocido: durante la etapa de recocido, los cebadores diseñados se adhieren al ADN de la muestra. Este es el primer paso que debe optimizarse antes de comenzar la reacción. Los científicos generalmente diseñan cebadores con una temperatura de fusión en el rango de 50-60 grados Celsius, lo que significa que la temperatura de hibridación en una PCR será de alrededor de 60 grados, 3-5 grados más baja que la temperatura de fusión de los cebadores. Bajar la temperatura promueve la unión a la muestra. Esta etapa suele durar de 10 a 45 segundos.
- Extensión: el tiempo de extensión permite que la polimerasa extienda el ADN y amplifique el producto final. Afortunadamente para los científicos, las polimerasas utilizadas para esta reacción tienen una temperatura óptima, siendo la más común 72 grados. Sin embargo, cada reacción requiere un tiempo de extensión óptimo, que depende del tamaño del producto deseado. La regla general es un minuto por cada 1000 pares de bases de ADN.
- Extensión final: se requiere una etapa de extensión final para garantizar que las polimerasas terminen de amplificar el producto deseado. Esta etapa está configurada para 72 grados (o la temperatura óptima especificada para la polimerasa que se usa) y generalmente dura cinco minutos.
Una vez que se completa la reacción, la reacción se puede almacenar en un refrigerador a 4 grados Celsius para almacenamiento a corto plazo, o en un congelador a -20 grados Celsius para almacenamiento a largo plazo, antes del análisis.
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Resumen de la lección
Esta lección cubrió algunas técnicas básicas de optimización para una reacción en cadena de la polimerasa . Algunas de estas técnicas se aplicaron antes de preparar la reacción, como el diseño de la imprimación y el tamaño de producto deseado. Afortunadamente, ciertas etapas de un PCR se han optimizado gracias a varios años de uso constante.
Un protocolo de PCR básico consta de cinco etapas, y las tres etapas intermedias se repiten en un ciclo. Optimizar este protocolo para la reacción específica de un científico puede ayudarlo a obtener los mejores resultados posibles sin la necesidad de repetir el experimento.
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