Ensayo de proteínas de Bradford: principio, protocolo y cálculos

Principio del ensayo de proteínas de Bradford

¿Cuánta proteína había en el huevo que acababa de comer? ¿O en el bar Snickers que tomaste de bocadillo? Hay varios métodos diferentes que se utilizan para medir la proteína en los alimentos. Uno de estos métodos es el ensayo de proteínas de Bradford .

El ensayo de proteínas de Bradford mide la concentración de proteínas añadiendo colorante Coomassie a la muestra en condiciones ácidas. Cuando las proteínas se unen con el tinte Coomassie, la muestra cambia de color de marrón a azul. El nivel de azul se puede medir usando un espectrofotómetro para determinar la concentración de proteína en la muestra.

Recuerde que hay 20 aminoácidos, bloques de construcción de proteínas, en el cuerpo. Técnicamente, el ensayo de proteínas de Bradford solo mide los aminoácidos básicos, arginina, lisina e histidina. Sin embargo, la mayoría de las proteínas tienen un nivel bastante equilibrado de estos aminoácidos con todos los demás aminoácidos, por lo que aún podemos extrapolar el nivel de proteína total en la muestra. Pero, si una muestra es particularmente alta o baja en cualquiera de estos aminoácidos, entonces esta no es la prueba adecuada para usar.

Estándares y pasos

Hay dos partes en el ensayo de proteínas de Bradford, primero el estándar y luego la muestra:

Estándar

Para el estándar, puede usar cualquier proteína completa, pero generalmente se usa albúmina de suero bovino (BSA) como estándar, ya que es barato y fácil de conseguir.

Paso 1: Prepare varias diluciones del estándar de BSA, al menos 5. Por ejemplo, las diluciones pueden ser de 5, 10, 25, 50, 75 y 100 microgramos de BSA por mililitro.

Paso 2: agregue reactivo (que contiene un ácido y el tinte de Coomassie) a las diluciones de BSA

Paso 3: Incube durante 5 minutos a 1 hora.

Paso 4: Mida la absorbancia con el espectrofotómetro ajustado a 595 nm

Los datos obtenidos aquí se pueden utilizar para crear un gráfico, con la absorbancia en el eje y y la concentración de proteína conocida en el eje x. Debería poder trazarse una línea bastante lineal entre cada uno de los puntos y determinar la ecuación de la línea.

Muestra

El proceso de muestra es muy similar al proceso estándar. La única diferencia es que no conocemos la concentración de la muestra. Si tiene una idea general de cuánta proteína hay en la muestra, entonces dilúyala para que esté dentro de la concentración de la curva estándar obtenida con el análisis BSA. Si la concentración de la muestra es completamente desconocida, utilice prueba y error. Si la absorbancia no cae entre 0,2-1 abs, cambie la dilución de la muestra hasta que la absorbancia esté dentro del rango adecuado.

Paso 1: Diluya la muestra para que quede dentro de la curva estándar de BSA

Paso 2: agregue el reactivo Bradford

Paso 3: Incubar durante 5 minutos a 1 hora (lo más cerca posible de cuánto tiempo se incubó la BSA)

Paso 4: Mida la absorbancia con el espectrofotómetro ajustado a 595 nm

Inserte la absorbancia en la ecuación determinada para el estándar. La absorbancia se conecta como y , y la concentración de proteína se determina mediante el cálculo x .

Cálculos de ejemplo

Primero repasemos los cálculos para determinar la ecuación de la curva estándar y luego veremos un ejemplo de cálculo de una concentración de proteína de muestra.

Estándar

Después de preparar los 5 estándares con diluciones de 0, 10, 25, 50 y 100 microgramos de BSA por mililitro e incubarlos con el reactivo durante 15 minutos, se obtienen estos colores de muestra en los tubos:

Luego mide la absorbancia a 595 nm y obtiene estos datos:

Ahora podemos crear un gráfico y determinar la ecuación de la línea usando estos datos:

Entonces, la ecuación de la curva estándar es: y = 0.0093x + 0.0073, que podemos reorganizar para resolver x :

Muestra

Digamos que no conocemos la concentración de proteína de nuestra muestra. Primero lo diluimos 1: 1, y la absorbancia es 1.5 abs. Dado que esto está por encima de nuestro rango de curva estándar, necesitamos diluir más esta muestra porque actualmente hay una mayor concentración de proteína de la que nuestra curva estándar puede manejar. Así que ahora lo diluimos a 1: 100 y obtenemos la absorbancia de 0.52 abs.

0.52 abs está dentro de nuestra curva estándar, por lo que podemos usar nuestra ecuación estándar, sustituyendo 0.52 para y y resolver para x :

En esta dilución, tenemos 55 microgramos de proteína en 1 mL de muestra. Pero recuerde, lo diluimos por 100 veces, por lo que debemos multiplicar esto por 100 para obtener nuestra concentración real en la muestra original. Así que tenemos 5,5 miligramos de proteína por mililitro de muestra.

Resumen de la lección

El ensayo de proteínas de Bradford mide la concentración de proteínas en una muestra. Este ensayo funciona midiendo el cambio de color logrado con los aminoácidos básicos combinados con el colorante Coomassie, que, en condiciones ácidas, cambia el color de la muestra de marrón a azul. Este cambio de color se puede controlar mediante un espectrofotómetro.

La concentración se calcula determinando la curva estándar de una concentración de proteína conocida, típicamente usando la proteína albúmina de suero bovino como estándar. Se puede determinar una ecuación a partir de esta curva estándar, y las concentraciones desconocidas se pueden calcular introduciendo la absorbancia determinada.