La tinción de Gram: teoría y procedimiento

La tinción de Gram clásica

Cada estudiante y profesional que trabaja con bacterias tiene que, en algún momento, aprender a hacer una tinción de Gram. La tinción de Gram es un procedimiento de tinción utilizado no solo para hacer que las células bacterianas sean más visibles bajo el microscopio, sino también para diferenciar los tipos de células según la composición de la pared celular. En esta lección, repasaremos paso a paso el procedimiento de tinción de Gram, explicando exactamente qué hacer y cómo cada paso contribuye a colorear y diferenciar las bacterias. Para obtener información de fondo más detallada y varias especies de ejemplo clave, consulte la lección ‘La tinción de Gram: organismos de fondo y de ejemplo’.

El procedimiento de tinción de Gram

La mejor manera de apreciar cómo la tinción de Gram puede diferenciar las bacterias en función de sus paredes celulares es sumergirse directamente en el proceso en sí. Antes de comenzar, recuerde que las células grampositivas aparecerán de color púrpura y las células gramnegativas aparecerán rojas después de la tinción adecuada. Antes de comenzar el proceso, tenemos que preparar su muestra bacteriana.

Las bacterias deben tener menos de 24 horas para garantizar resultados precisos. Las bacterias deben esparcirse en una capa delgada a través de un portaobjetos de microscopio. Una capa fina asegurará una tinción uniforme y completa. Una vez aplicadas al portaobjetos, las bacterias deben fijarse con calor agitando la parte inferior del portaobjetos sobre una llama abierta. La diapositiva debe calentarse, pero no caliente. Demasiado calor puede distorsionar las células o incluso romper el portaobjetos de vidrio. Un calentamiento suave matará las bacterias y las pegará al portaobjetos para que no se puedan enjuagar fácilmente. Ahora es el momento de empezar a teñir.

Paso 1: Cubra la superficie del portaobjetos con violeta cristal durante un minuto. El violeta cristal es la mancha principal. Teñirá las bacterias de un color morado oscuro. El cristal violeta penetrará las paredes celulares de todas las bacterias, haciendo que todas parezcan moradas bajo el microscopio.

Paso 2: enjuague suavemente la mancha del portaobjetos. Esto se logra más fácilmente inclinando el portaobjetos debajo de un grifo que corra ligeramente y enjuagando con agua corriente hasta que el agua salga limpia. El exceso de violeta cristal se escurrirá en el fregadero, mientras que la mancha que penetró en las paredes de la celda permanecerá.

Paso 3: Cubra el portaobjetos con yodo de Gram durante un minuto. El yodo de Gram sirve como mordiente. Un mordiente es una sustancia que se combina con tinte o tinte para mejorar la capacidad de tinción. El yodo forma un complejo compacto con el cristal violeta, formando compuestos de mayor tamaño. Este tamaño más grande ayuda al cristal violeta a resistir el enjuague de las paredes celulares durante los últimos pasos de enjuague.

Paso 4: Enjuague suavemente el yodo de Gram del portaobjetos. El mismo enjuague con agua del grifo también funciona bien aquí. En este punto, si miró el portaobjetos bajo el microscopio, todas las células todavía parecerán moradas por la tinción de violeta cristal.

Paso 5: decolorar el portaobjetos con etanol al 95%. Este es el paso más importante del procedimiento y el más fácil de estropear, lo que invalidaría sus resultados. Desea inclinar el portaobjetos ligeramente y gotear muy lentamente el decolorante de etanol sobre el portaobjetos. Notarás que el decolorante recoge la mancha púrpura a medida que pasa por tus células. Debe dejar de decolorar tan pronto como el decolorante se vea claro saliendo del portaobjetos.

Lo que en realidad está sucediendo es que el etanol disuelve las grasas, también llamadas lípidos, en la membrana externa de las células gramnegativas. Estas son las células con la fina capa de peptidoglicano. Sin la membrana externa, la pared celular se vuelve porosa, lo que permite enjuagar todo el cristal violeta. El peptidoglicano espeso de las células Gram-positivas atrapa el cristal violeta entre las capas. Si miras las células bajo el microscopio ahora, las células grampositivas seguirían apareciendo de color púrpura. Las células Gram negativas, habiendo perdido su tinte, aparecerían transparentes.

Tenga cuidado aquí, este paso es el más fácil de estropear. Decolore demasiado y también puede quitar el cristal violeta de las células Gram-positivas, haciéndolas parecer transparentes. Si se decolora muy poco, las células Gram negativas retendrán suficiente cristal violeta para que parezcan moradas.

Paso 6: Enjuague suavemente con agua como antes.

Paso 7: aplique el tinte de safranina durante un minuto. La safranina es la contratinción, convirtiendo las células en color rojo. Teñirá tanto las células Gram positivas como las Gram negativas, pero el violeta oscuro del cristal violeta dominará al rojo más claro de la safranina en las paredes de las células Gram positivas. Las bacterias grampositivas seguirán apareciendo de color púrpura. Las células Gram negativas previamente transparentes absorberán la safranina y aparecerán rojas.

Paso 8: Enjuague suavemente con agua como antes.

Paso 9: seque suavemente el portaobjetos. En este punto, se utilizan toallas de papel ordinarias o tabletas especiales de papel secante para secar suavemente el exceso de mancha y agua. Nunca frote y seque el portaobjetos. Esto borrará todo su arduo trabajo.

Eso es. ¡Ahora puede colocar su portaobjetos en el microscopio y ver sus resultados! Si lo hizo todo correctamente, debería tener una mezcla de células grampositivas púrpuras y células gramnegativas rojas. No es infrecuente que el primer (o segundo, tercer y cuarto) intento no sea concluyente o no se haya teñido correctamente. Esta es una técnica delicada que requiere mucha práctica para bajar. Así que no se desanime. ¡Sigue manchando!

Resumen de la lección

Repasemos brevemente el procedimiento de tinción de Gram. El procedimiento es el siguiente:

• Paso 1: Cubra la superficie del portaobjetos con violeta cristal durante un minuto.
• Paso 2: enjuague suavemente la mancha del portaobjetos.
• Paso 3: Cubra el portaobjetos con yodo de Gram durante un minuto.
• Paso 4: Enjuague suavemente el yodo de Gram del portaobjetos.
• Paso 5: decolorar el portaobjetos con etanol al 95%.
• Paso 6: Enjuague suavemente con agua como antes.
• Paso 7: aplique el tinte de safranina durante un minuto.
• Paso 8: Enjuague suavemente con agua como antes.
• Paso 9: seque suavemente el portaobjetos.

Debería quedarse con células grampositivas violetas y células gramnegativas rojas.

Los resultados del aprendizaje

Después de completar este video, debería poder realizar una tinción de Gram con confianza.

Rodrigo Ricardo Editor y fundador