Técnicas de laboratorio molecular: procedimientos de transferencia y sondaje

Publicado el 17 agosto, 2021

¿Qué es el blotting?

¿Alguna vez has escuchado la expresión “encontrar una aguja en un pajar”? Este dicho proviene de la idea de que puede ser muy difícil encontrar algo si se mezcla con muchas otras cosas similares. Cuando empezamos a pensar en clasificar todas las moléculas dentro de las células vivas, esta expresión ciertamente suena cierta.

Las proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y carbohidratos que forman las células están más allá de lo microscópico. Sin embargo, estas son las moléculas que se desregulan durante los estados de enfermedad y, por lo tanto, los científicos están muy interesados ​​en monitorear sus cambios. Pero, ¿cómo pueden los científicos hacer esto cuando ni siquiera pueden verlos?

Una solución se llama blotting . La transferencia es el proceso de separar macromoléculas biológicas por tamaño, generalmente mediante electroforesis en gel, y luego transferirlas a una membrana sólida. Después de la transferencia, los científicos pueden detectar moléculas de interés. Para hacer esto, los científicos usan una sonda , una molécula que es una combinación perfecta para su molécula de interés y generalmente está etiquetada con algún tipo de color o luz para ayudarlos a identificar cuándo está presente la molécula de interés.

Hay tres tipos principales de transferencias que utilizan los científicos: transferencias del sur, del norte y del oeste, pero todas tienen pasos similares. Repasemos ellos.

Paso 1. Separación de gel

Southern Blot

Las transferencias de Southern usan electroforesis en gel para separar fragmentos de ADN, luego transferirlos a una membrana sólida y luego detectarlos usando una sonda complementaria.

Primero, la muestra de ADN se purifica y el ADN se digiere con enzimas de restricción para formar fragmentos que se pueden pasar a través de un gel. A continuación, las muestras se cargan en pocillos de un gel de agarosa y se conectan a una fuente de alimentación. La fuente de alimentación produce una corriente que provoca la migración de moléculas de ADN cargadas negativamente a través del gel. Debido a la matriz de agarosa, las moléculas más grandes migran más lentamente y se enrollan hacia la parte superior del gel, y los fragmentos más pequeños migran más rápido y se enrollan hacia la parte inferior del gel.

Northern blot

El proceso es similar para las transferencias Northern , que utilizan ARN. Sin embargo, las muestras se separan con un gel desnaturalizante con formaldehído. Se debe tener especial cuidado al aislar muestras de ARN. Las enzimas que destruyen el ARN están en todas partes y los investigadores deben tener cuidado de no contaminar sus muestras.

Western Blot

En lugar de gel de agarosa, las transferencias Western utilizan geles de poliacrilamida para separar proteínas. Para realizar una transferencia de Western, la mayoría de las muestras están muy desnaturalizadas, por lo que se separarán solo en función del peso molecular en lugar de la estructura tridimensional. Esta técnica se llama electroforesis en gel de página SDS.

Paso 2: Transferencia

Después de la electroforesis en gel, las muestras deben transferirse del gel a una membrana sólida, como nailon para ADN o ARN y nitrocelulosa para proteínas.

Transferencia del sur y del norte

Primero, el gel se lava y luego se coloca encima de papel Whatman en una plataforma. A continuación, se coloca en capas la membrana de nailon, seguida de capas adicionales de papel Whatman. Todo se empapa en un tampón con alto contenido de sal, generalmente 10X SSPE. El papel Whatman absorberá el tampón, tirando del ADN hacia la membrana de nailon cargada positivamente donde puede unirse. Por último, después de que se transfiere el ADN, se aplica luz ultravioleta a la membrana para reticular el ADN en su lugar.

Western Blot

Las transferencias de Western se transfieren con mayor frecuencia utilizando una corriente eléctrica. La corriente impulsa las proteínas cargadas negativamente a través del gel donde se unen a la superficie de una membrana de nitrocelulosa.

Paso 3: bloqueo

El bloqueo se realiza para evitar la unión inespecífica de la sonda contra las muestras en la membrana.

Transferencia del sur y del norte

Para las transferencias Southern y Northern, el paso de bloqueo incluye incubar la membrana con ADN de esperma de salmón. Aunque esto puede parecer asqueroso, el ADN del esperma de salmón se une a sitios no específicos de la membrana, lo que evitará que la sonda marcada se una más tarde.

Western Blots

Dado que las transferencias Western detectan proteínas, la membrana se incuba típicamente con una solución de proteína como leche baja en grasa o albúmina de suero bovino. Después del bloqueo, cualquier membrana se lava en un tampón para eliminar el exceso de solución de bloqueo.

Paso 4: sondas

El siguiente paso es unir la sonda a la molécula de interés en la membrana, lo que se denomina hibridación de la sonda .

Transferencia del sur y del norte

Tanto las transferencias Southern como Northern se basan en la hibridación de ácidos nucleicos en la que las secuencias complementarias de ácidos nucleicos como el ADN o el ARN se hibridan o se unen entre sí cuando se mezclan. Las sondas están diseñadas para ser complementarias de la molécula de interés y normalmente llevan una etiqueta, como un nucleótido radiactivo o un fluoróforo.

Primero, la sonda se incuba con la membrana durante la noche, generalmente se calienta a aproximadamente 49 grados dependiendo de la especificidad de la sonda para el objetivo. Luego, al día siguiente, se debe lavar la membrana para eliminar la sonda no unida. Esto se hace usando lavados de diferentes rigurosos. Primero, se aplica un lavado de bajo rigor para eliminar la unión no específica. Luego, después de unos pocos lavados de bajo rigor, se usa un lavado de alto rigor para eliminar cuidadosamente la unión que es altamente homóloga a la secuencia objetivo.

Western Blot

Los Western blots utilizan anticuerpos como sondas en lugar de secuencias de ácidos nucleicos, ya que se utilizan para detectar proteínas. Se producen anticuerpos que son una combinación perfecta para una proteína objetivo en particular. Por lo general, se aplica este primer anticuerpo primario y luego se lava la mancha. A continuación, se aplica un anticuerpo secundario que contiene un cromógeno, una enzima productora de color o fluoróforos, que se une al anticuerpo primario. Luego, la mancha se lava nuevamente para eliminar cualquier exceso de anticuerpo secundario.

Paso 5: detección

El método de detección depende del tipo de sonda que se utilizó. Si la sonda era radiactiva, como en la transferencia Southern o Northern, una imagen de rayos X del gel revelará cualquier unión de la sonda. Para las transferencias Western, los cambios cromogénicos de color se pueden visualizar a plena luz.

Resumen de la lección

La transferencia es el proceso de separar macromoléculas por tamaño y transferirlas a una membrana para su detección. Hay varios pasos para secar.

Paso 1: Separación de gel. La separación de la macromolécula se produce utilizando un gel de agarosa para el ácido nucleico y un gel de poliacrilamida para la proteína.

Paso 2: Transferencia. Los ácidos nucleicos se transfieren mediante difusión a una membrana de nailon, mientras que las proteínas se transfieren típicamente mediante corriente eléctrica a una membrana de nitrocelulosa.

Paso 3: bloqueo. Durante la fase de bloqueo , las membranas se exponen a un exceso de ácido nucleico o proteína para unirse a sitios de unión no específicos.

Paso 4: Sondas. Las secuencias de ácido nucleico complementarias con radiomarcadores o fluoróforos se incuban con transferencias Northern o Southern. Luego, las transferencias se lavan usando diferentes rigurosidades para eliminar la unión no específica. Las transferencias de Western utilizan anticuerpos marcados con marcadores cromogénicos o fluorescentes.

Paso 5: detección. Se detectan los cromógenos, fluoróforos o radiactividad para evaluar la presencia de la molécula de interés.

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